斑马鱼干扰素γ基因克隆表达及生物信息学分析.pdf

北京协和医学院硕士研究生论文摘要：目的：克隆斑马鱼的新基因i f n 9 1 ．J 和i f n 9 1 ．2 ，验证其编码产物是否为干扰素Y ；构建两个基因的原核表达载体，实现其原核重组表达，为深入研究这两个基因的功能奠定基础方法和内容：首先通过e o n A 药浴，人工诱导斑马鱼干扰素的表达即刻提取组织总R N A ，通过R T - P C R 检测这两个基因的表达情况，并对P C R 产物进行测序以验证结果的正确性然后将这两个基因克隆入表达载体p E T 2 4 a ，构建高效表达载体p E T 2 4 a - i f n 9 1 ．1 和p E T 2 4 a —i f n 9 1 ．2 ，并将这两个基因做原核融合表达同时运用生物信息学方法分析这两个基因的结构及功能域，进一步验证这两种斑马鱼干扰素7 基因是否存在结果：利用R T - P C R 方法，成功地从经过c o n A 药浴的斑马鱼组织中扩增出与预期大小一致的D N A 片段，而未经药浴的斑马鱼体内没有扩增到相应的D N A 片段通过测序证实了P C R 产物就是目的基因的片段表明这两个基因都能够被c o n A 诱导表达，符合干扰素的基本特性，证实这两个基因不是假基因，但有可能是干扰素类物质。

将目的基因连入表达载体p E T 2 4 a ，成功地构建了重组表达载体p E T 2 4 a ．i f n 9 1 ．1 和p E T 2 4 a ．i f n 9 1 ．2 将载体转化B L 2 1 并用I P T G 诱导融合蛋白的表达，经S D S ．P A G E 检测，成功的得到了和目的蛋白大小一致的产物生物信息学分析表明，这两个基因产物的大小、等电点、部分保守序列等符合干扰素Y 的特征但和人的干扰素相比I f n 9 1 ．2 比I f n 9 1 ．1 具有更高的同源性，二级结构和三级结构的预测结果显示，I f n 9 1 ．1 具有5 - a 螺旋结构，而I f n 9 1 ．2 具有6 - a螺旋结构干扰素丫的一个重要特征是具有6 - a 螺旋结构，因此I f n 9 1 ．2 明显符合干扰素丫的特点系统进化分析表明，虽然i f n 9 1 ．1 和i f n 9 1 ．2 在基因组上紧密连锁，但在长期进化过程中二者已经发生了明显分化其中，i f n 9 1 ．2 和其它鱼类干扰素丫有较近的亲缘关系，而i f n 9 1 ．1 则较早从鱼类干扰素Y 中分化并形成了新的分支。

结论：本实验结果显示：I f n 9 1 ．1 和I f n 9 1 ．2 都具有干扰素丫的一些基本特征；其中I f n 9 1 ．2 即为干扰素Y ；I f n 9 1 ．1 在长期的进化过程中基因序列发生了大量变化而导致其结构的改变，属于从干扰素丫中分化出的新的一类干扰素关键字：斑马鱼；干扰素7 ；原核表达；生物信息学北京协和医学院硕士研究生论文A B S T R A C To b j e e t i v 铭：T oc l o n et w oz e b r a f i s hg e n e s 矽堙J 『一J 『a n di f n g l 一2 ；t oc o n f i r mw h e t h e ri f n g l - ja n di f n g l - 2e n c o d ez e b r a f i s hi n t e r f e r o ng a m m a ；t oc o n s t r u c tt w oe x p r e s s i o nv e c t o r sc o n t a i n i n gi f n g l 一1a n di f i a g l - 2 ；t ol a yt h ef o u n d a t i o nf o rf u r t h e rf u n c t i o n a ls t u d i e so fz e b r a f i s hi n t e r f e r o ng a m m a ．M e t h o d s ：E x p r e s s i o no fi n t e r f e r o ng a m m ag e n ew a si n d u c e db ym e d i c a lb a t ho fz e b r a f i s hw i t he o n A ．T o t a lR N AW a si m m e d i a t e l ye x t r a c t e da n dt h ei n t e r f e r o ng a m m ag e n ew a sa m p l i f i e db yR T - P C R ．A m p l i f i e dD N Af i ' a g m e n t sw e r es e q u e n c e dt oi d e n t i f yi ft h e s eP C Rp r o d u c t sa r ef r o mt a r g e tg e n e s ．T a r g e tg e n e sw e r es u b c l o n c di n t oav e c t o ro fp E T 2 4 at oc o n s t r u c tr e c o m b i n a n tV e c t o r sp E T 2 4 a - i f i a g l ·1a n dp E T 2 4 a - i f n g l 一2 ．T h ee x p r e s s i o no faf u s i o np r o t e i nW a si n d u c e dw i t hI P T Ga f t e rt r a n s f o r m i n gt h ev e c t o r si n t oB L 21 ( D E 3 ) ．F i n a l l y , w ec o n f i r m e dt h ee x p r e s s i o no ft h ef u s i o np r o t e i nw i t l lS D S ．P A G Ee l e c t r o p h o r e s i sa n da n a l y z e dt h e i rs t r u c t u r e sa n df u n c t i o n a ld o m a i n sb yb i o i n f o r m a t i c s ．R e s u l t s ：E x p r e s s i o no fi f n gl - 1o ri f n gl - 2W a si n d u c e db ym e d i c a lb a t hw i t hc o n A ．W es u c c e s s f u l l yc l o n e di f n g l ·1a n di f n gl - 2a n dc o n f i r m e dt h e mb ys e q u e n c i n g ．R e c o m b i n a n te x p r e s s i o nv e c t o r so fp E T 2 4 a - i f n gl - 1a n dp E T 2 4 a - i f n gl ·2w e r ec o n s t r u c t e da n dp r o k a r y o t i ce x p r e s s i o n so ft h e s ef u s i o np r o t e i n sw e r es u c c e s s f u l l yc o m p l e t e d ．B i o i n f o r m a t i c sa n a l y s i si n d i c a t e st h a tI f n g l - ·1a n dI f n g l ·- 2a l es i m i l a rt oo t h e ri n t e r f e r o ng a m m a si nr e l a t i v em o l e c u l a rm a s s ，i s o e l e c t r i cp o i n t sa n da m i n oa c i ds e q u e n c e so fs o m ec o n s e r v e dd o m a i n s ．A f t e rP r e d i c t i n gt h es e c o n d a r ys t r u c t u r ea n dt e r t i a r ys t r u c t u r eb yb i o i n f o r m a t i c sa n a l y s i s ，w eh a v ef o u n dt h a tk n o w ni n t e r f e r o ng a m m a sa n dI f n gl - 2h a v es i m i l a r6 - ah e l i xs t r u c t u r e s , b u tI f n gl 一1h a s5 - ah e l i xs t r u c t u r e s ．T h e s ed a t as u g g e s tt h a tI f n gl - 2i st h ep u t a t i v ez e b r a f i s hi n t e r f e r o ng a m m a ．C o n c l u s i o n s ：I nt h es t u d y , I f n g l 一2 ，b u tn o tI f n g l - 1 ，W a si d e n t i f i e da Sat y p eI Ii n t e r f e r o n ．E x p r e s s i o no fz e b r a f i s hi f n g l —J 『a n di f n g l 一2C a nb ei n d u c e db yc o n & s u g g e s t i n gt h a tb o t hg e n e sa r en o tp s e u d o g e n e sa n dm a yh a v es o m ef u n c t i o n si nz e b r a f i s hi m m u n er e s p o n s e ． A m i n oa c i ds e q u e n c ea n ds t r u c t u r eo fI f n g l - 1a l el e s sc o n s e r v a t i v ed u r i n ge v o l u t i o nb e c a u s eo fa b u n d a n tm u t a t i o n si ni t sg e n e ．A l t h o u g hz e b r a f i s hi f n g l 一，a n di f n 9 1 ．2a r e4北京协和医学院硕十研究生论文c l o s e l yl i n k a g e di nt h eg e n o m e ，t h e yh a v es i g n i f i c a n td i f f e r e n c e si ns e q u e n c ea n ds t r u c t u r e ．E v i d e n c ef r o mt h es t u d ys u g g e s t st h a tI f n g l 一2i sam e m b e ro fi n t e r f e r o nI If ．锄i l y ．F u r t 。