山羊卵泡中卵丘扩展抑制因子的分泌及鉴别(1).pdf

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＼ 1 ， ， r． ． y ；●夕 ． V ；√少 k l q P o I 气 目录 中文摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯· IQgOIOO OO ⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯1 A b s t r a c t ·············································0 0 0 ···600 ························3 1 ．前言⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯·Q OOOO ⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯”⋯·6 1 ．1 颗粒细胞与卵母细胞的关系⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯6 1 ．2 卵母细胞与卵丘扩展的关系⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯7 1 ．3 卵丘扩展及其生理学意义⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯? ⋯⋯⋯⋯··8 1 ．4 卵丘扩展的机制⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯·l t t OOO OO IO ⋯⋯8 1 ．5 卵泡中的C E I F 研究现状⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯··m OO ·1 0 1 ．6 卵泡液中的C E E F 与C E I F ⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯1 1 1 ．7 卵泡液中C E I F 抑制卵丘扩展的可能机理⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯1 l 1 ．8C E I F 的可能候选因子⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．．⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯1 2 1 ．9 本文主要研究内容⋯⋯⋯⋯⋯⋯g g O B OQ ⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯OO e 0 00 ⋯1 8 2 ．材料与方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯O O O Oq P9 ⋯⋯⋯⋯I pq lO O Og ⋯⋯⋯·? ⋯⋯·aO O O OO ·gO ⋯1 9 2 ．1 主要试剂及配制⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯1 9 2 ．2 山羊C O C s 的获取⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯2 0 2 ．3 小鼠C O C s 的获取⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯2 0 2 ．4 小鼠O O X s 的制备⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．．⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯2 0 2 ．5 卵泡直径的测量⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯2 1 26 卵泡液收集⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯2 1 2 ．7 细胞单层的制备⋯⋯⋯⋯⋯⋯? ⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯··2 1 2 ．8 条件培养基的制备⋯⋯⋯a I @ ··O O QO ·⋯⋯·O0 0 00 ⋯⋯⋯⋯⋯⋯44 44 1 ·OB I D O ⋯2 2 29 山羊的超排处理⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯e o loogoeooo q loooooo ⋯⋯o q lo0o ·4 pg ·⋯2 2 2 ．1 0C E E F 的检测方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯2 2 2 ．1 1C E I F 的检测方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯2 3 2 ．1 2 山羊卵丘扩展的分级⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯2 3 2 ．1 3 显微操作工具的制备⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯2 3 2 ．1 4D M B 检测大、中卵泡液及膜细胞、卵丘细胞条件化培养基中S - G A G 的含量⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯q J B·elg ⋯q ·O I DO le ⋯⋯q P q l l 0g lQ O0 0q l 一⋯2 4 2 ．1 5 毛细管电泳⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．．⋯2 4 2 ．1 6 脂肪酸组成测定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯2 4 2 ．1 7 实验设计⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯··：⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯2 5 2 ．1 8 数据分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯2 7 3 ．实验结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯2 8 3 ．1 山羊卵泡中C E E F 与C E I F 的存在情况及来源⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯2 8 3 ．1 ．1 山羊中卵泡( 2 ．4 r a m ) 卵泡液中C E E F 与C E I F 的具体存在情况⋯2 8 3 ．1 ．2 山羊大卵泡液( 5 ．6 m m ) 中C E E F 与C E I F 的具体存在情况⋯⋯⋯2 8 3 ．1 ．3P G 后2 4 小时、H C G 后2 0 小时所取的5 - 7 m m 卵泡液中C E E F 与C E I F 的存在情况⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯2 9 3 ．1 ．4 卵泡中各种体细胞( 膜细胞、卵丘细胞、壁颗粒细胞) 分泌C E E F 与C E I F 的情况⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯? ⋯⋯⋯“3 1 3 ．2 山羊卵丘扩展抑制因子的鉴定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯3 4 3 ．2 ．1D M B 检测大、中卵泡液及膜细胞、卵丘细胞条件化培养基中S - G A G 的含量⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯3 4 3 ．2 ．2 各种S - G A G 对小鼠C O C s 卵丘扩展的抑制作用⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯3 5 3 ．2 ．3 各种S - G A G 对山羊C O C s 卵丘扩展的抑制作用⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯3 6 3 ．2 ．42 - 4 m m 、5 - 6 m m 卵泡液对山羊C O C s 卵丘扩展的作用⋯⋯⋯⋯⋯3 7 V 7 * √ p J I ， k ， q 山东农业大学硕士学位论文 中文摘要 在排卵前，经一系列内源性促性腺激素峰的刺激，围绕在卵母细胞周 围的紧实的卵丘细胞发生扩展，这种现象称为卵丘扩展或粘液化。

卵丘扩 展对排卵和受精过程都具有重要的意义之前的研究表明卵泡液中都存在 一种能够抑制卵丘扩展的因子本文研究了山羊卵泡中C E I F ( c u m u l u s e x p a n s i o ni n h i b i t i n gf a c t o r s ) 的存在情况及来源我们使用种间测试系统， 应用小鼠摘除卵母细胞的卵丘卵母细胞复合体( o o c y t e c o m i z e dc o m p l e x ， O O X s ) ，检测山羊中、大卵泡液及中卵泡中各种体细胞分泌C E E F 的情况 利用小鼠C O C s 检测山羊中、大卵泡液及卵泡中各种体细胞分泌C E I F 的 情况，并尝试确定C E I F 是何种物质我们还检测了四种氨基葡聚糖对小 鼠C O C s ，山羊C O C s 的卵丘扩展的作用 结果如下： ． 1 、1 0 ％、5 0 ％的中卵泡液能够使小鼠O O X s 发生5 5 ．6 0 ％的扩展，也就是 说山羊中卵泡液中存在C E E F ；1 0 0 ％的中卵泡液能够抑制小鼠C O C s 的扩 展，说明中卵泡液中含有C E I F 2 、在各种不同浓度大卵泡液中培养的小鼠O O X s 都没有扩展，也说明大 卵泡液中不含有C E E F ；各种不同浓度大卵泡液中培养的小鼠C O C s 都发 生扩展，说明山羊大卵泡液中不含有C E I F 。

3 、在各种不同浓度P G 后2 4 小时卵泡液中培养的小鼠O O X s 都没有扩展， 说明此卵泡液中不含有C E E F ；同样处理的小鼠C O C s 都能发生扩展，说 明此P G 后2 4 小时卵泡液中不含有C E I F 4 、在各种不同L H 后2 0 小时所取的卵泡液中培养的小鼠O O X s 都能够扩 展，而且绝大多数O O X s 都是四级扩展，说明L H 后2 0 小时所取的卵泡 液中含有大量的C E E F ；同样处理的小鼠C O C s 都能够扩展，且绝大多数 是四级扩展，说明L H 后2 0 小时所取的卵泡液不含有C E I F 5 、卵丘细胞和壁颗粒细胞条件化培养基具有C E E F 活性，而不具有C E I F 活性与卵丘细胞和壁颗粒细胞不同，膜细胞条件化能够使小鼠C O C s 的 扩展抑制在2 0 ％，说明膜细胞条件化培养基既具有C E l T 活性，也具有 C E E F 活性中卵泡液中的C E I F 很有可能来自膜细胞 山羊卵泡中卵丘扩展抑制因子的分泌及鉴别 6 、山羊中卵泡液( 2 - 4 m m ) 、大卵泡液( 5 , - , 6 m m ) 、体内P G 后2 4 小时所 取卵泡液、L H 峰后2 0 小时卵泡液中氨基葡聚糖的含量依次是1 ．2m g ／m l 、 0 ．9 1m g ／m l 、0 ．6m g ／m l 、0 ．7 m g ／m l 。

卵丘细胞条件化、膜细胞条件化中氨 基葡聚糖的含量为0 ．1 4m g ／m l 、0 ．1 2 m g ／m l 7 、氨基葡聚糖( H e p 、C S ．B 、H S 、C S ．C ) 对于小鼠C O C s 扩展的抑制浓 度依次是0 ．0 1 m g ／m l 、O ．1 m g ／m l。