微生物之棒状杆菌课件.pptx

单击此处编辑母版标题样式,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,2020/9/14,#,棒状杆菌属种属及毒力鉴定,江苏嘉语生物医药技术有限公司,陈颖曦,内容概要,棒状杆菌属及白喉棒状杆菌简介,棒状杆菌与疾病,常用种属鉴定靶点及序列比对,棒状杆菌毒力因子及序列比对,文献,棒状杆菌属及白喉棒状杆菌简介,棒状杆菌属(,Corynebacterium,)是一群革兰染色阳性杆菌本属细菌的特点是菌体一端或两端膨大呈棒状，菌体染色不均匀，可出现异染颗粒该菌属无荚膜、无鞭毛，不产生芽胞种类较多，广泛分布于动、植物可在人体皮肤、上呼吸道和泌尿生殖道粘膜等处定居大多为非致病菌或条件致病菌，其中白喉棒状杆菌是唯一能引起人类致病且具较强传染性的菌种白喉棒状杆菌的异染颗粒,（Albert染色）,白喉棒状杆菌(C.diphtheriae)，俗称白喉杆菌，是白喉的病原菌白喉是一种急性呼吸道传染病，患者咽喉部粘膜可出现灰白色的假膜该菌能产生强烈外毒素，进入血液可引起全身中毒症状菌体细长微弯，一端或两端膨大呈棒状。

细菌排列不规则，常排列呈V、L等形状革兰染色阳性用美蓝短时间染色菌体着色不均匀，出现有深染的颗粒用Neisser或Albert 等法染色，这些颗粒与菌体着染颜色不同，称为异染颗颗粒的主要成分是核糖核酸和多偏磷酸盐，在鉴定时有重要意义但当细菌衰老时异染颗粒被消耗而不明显，且细胞壁变薄易被脱色，常造成革兰染色不定，有时可表现为在革兰阴性的菌体中见有阳性颗粒或节段需氧或兼性厌氧在血平板上可生长，菌落大小13mm在含有凝固血清的吕氏血清斜面上生长迅速，涂片染色异染颗粒明显分离培养时常用亚碲酸钾血平板作为鉴别选择培养基因亚碲酸钾能抑制杂菌，而白喉棒状杆菌不受影响，并能吸收亚碲酸盐使其还原为黑色的金属碲，菌落呈黑色白喉棒状杆菌在亚碲酸钾血平板上可形成三种不同形态特征的菌落，分别称为重型、轻型和中间型三型的产毒株与疾病的轻重程度无明显的对应关系，但对流行病学分析具有一定意义在我国以轻型多见白喉棒状杆菌对湿热抵抗力不强，58,C 10分钟或煮沸1分钟死亡但对寒冷、干燥和日光的抵抗力较其他无芽胞菌强在衣服、床单、玩具上可存活数天至数周对常用消毒剂抵抗力较弱，5%石碳酸1分钟、3%来苏尔10分钟处理可杀灭。

对青霉素、氯霉素、红霉素等敏感棒状杆菌与疾病,棒状杆菌种名,临床疾病与症状,Cdiphtheriae,临床上引起白喉，主要侵犯口咽、鼻咽等部位，局部形成灰白色假膜，有咽白喉、喉白喉、鼻白喉和气管白喉之分其产生的外毒素可损害心肌和神经系统，病死率高，死亡的病例中50%以上是由于心肌受损发展到充血性心力衰竭所致，可引起心肌炎、软腭麻痹、声嘶、肾上腺功能障碍等症状此外，本菌可侵犯眼结膜、外耳道、阴道和皮肤伤口,Cpseudodiphtheriticum,偶尔可引起心内膜炎、尿路感染、骨感染,Culcerans,可产毒素，引物呼吸道白喉样疾病，也与奶牛乳腺炎有关,Camycolatum,可引起心内膜炎,Cstriatum,关节炎，败血症,Cjeikeium,在免疫抑制或免疫功能不全的人身上引起机会性感染，比如骨髓移植中引起的机会性感染，也可引起关节炎，心内膜炎，败血症Curealyticum,可引起泌尿道感染，产生大量尿素酶使尿液变碱，易导致结石形成Cxerosis,常寄居于眼结膜，可引起关节炎，心内膜炎，胸膜肺炎，腹膜炎，骨髓炎，脓毒性关节炎，脑膜炎等Cpseudotuberculosis,可引起小反刍动物干酪样淋巴结炎,Cbovis,可引起牛乳房炎,Crenale,引物牲畜膀胱炎和肾盂肾炎,Cpyogenes,从牛、羊和猪的化脓性损伤中分离到，跟奶牛乳腺炎有关，人类感染已有报告.,常用种属鉴定靶点及序列比对,靶微生物,基因,生理功能,特异性,敏感性,备注,C.pseudotuberculosis,16S1,11,核糖体RNA,假阳性,与C.ulcerans交叉,C.diphtheriae,C.ulcerans,tox2,5,6,8,9,10,12,13,14,白喉毒素,假阴性,10 copies per reaction tube,某些菌株不含有此基因,C.diphtheriae,C.ulcerans,rpoB2,11,RNA聚合酶,亚基B,10 copies per reaction tube,C.diphtheriae,dtxR3,12,代谢调节和毒素合成调节因子,100%,C.pseudotuberculosis,rpoB4,RNA聚合酶,亚基B,100%,1pg,和16S联用3重PCR特异性达100%，敏感性达1pg,C.pseudotuberculosis,Pld4,外毒素PLD,100%,1pg,靶微生物,基因,生理功能,特异性,敏感性,备注,C.Jeikeium,C.urealyticum,16S-23S7,核糖体,RNA间区,16S-23S序列多态能够清楚区分这两个种,种属鉴定靶点的选定,16S作为国际公认的细菌分类“金标准”，作为细菌属的鉴定靶点是得到认可的，在已下载到的棒状杆菌文献中，缺乏关于棒状杆菌属鉴定靶点的描述，介于16S在分类上应用的普遍性和权威性，在此将,16S,暂定为棒状杆菌属的鉴定靶点。

代谢调控因子编码基因dtxR和RNA聚合酶亚基B编码基因rpoB是白喉棒状杆菌鉴定讨论最多的靶点，特别是dtxR在白喉的鉴定中表现出良好的特异性，现将,dtxR,作为白喉的,首选,鉴定靶点，,rpoB,作为,备选，,以区分白喉和非白喉换句话说，只要16S显阳性，排除假阳性的结果，就认为是棒状杆菌属的细菌，再加上dtxR和rpoB显阳性，排除假阳性结果，就说明是白喉，如果是阴性就说明是棒状杆菌的其他种，其他种在这不进行细致的鉴定临床上棒状杆菌中的致病种包括白喉棒状杆菌在内，有36个种，然而在此不可能将数目众多的种都考虑进去，产毒白喉棒状杆菌（Cdiphtheriae）是最主要的致病种，也是绝对致病种，在本课题中作为重点考虑，此外，在16S的比对中将条件致病种Cpseudodiphtheriticum，Culcerans，Camycolatum，Cstriatum，Cjeikeium，Curealyticum和Cxerosis考虑进去，另加跟牛乳腺炎有关的2个种：Cbovis和Cpyogenes16S序列比对,选取白喉棒状杆菌（,C.diphtheriae）等10个种的16S序列进行比对，共计278条序列。

棒状杆菌属鉴定16S-1,由于文献都是直接用靶基因鉴定到种，没有用16S属的鉴定棒状杆菌属的引物，属引物还需自行设计dtxR序列比对,选取白喉棒状杆菌21条dtxR序列进行比对,文献中dtxR引物,Target microb,序列（5-3）,Location,产物长度(bp),白喉3,GGGACTACAACGCAACAAGAA,CAACGGTTTGGCTAACTGTA,568-588,809-828,260,rpoB序列比对,选取白喉（Cdiphtheriae）等9个种的rpoB序列进行比对，合计102条文献中的棒状杆菌rpoB引物,Target microb,序列（5-3）,Location,产物长度(bp),C.Pseudotuberculosis4,CGTATGAACATCGGCCAGGT,TCCATTTCGCCGAAGCGCTG,2767-2786,3208-3227,446,棒状杆菌毒力因子及序列比对,种,主要毒力因子,相关基因,分布率,备注,C,diphtheriae,白喉毒素（DT）,Tox2,3,5,8,11,12,14，15,54%5,该种某些菌株不携带该毒素，为溶原噬菌体携带,A,B两个亚基组成,有的菌株只有A亚基，有的只有B,C,ulcerans,白喉毒素（DT）,Tox2,8,10,11/209,A,B两个亚基组成,外毒素PLD,（鞘磷脂酶）,PLD4,_,_,C.pseudotuberculosis,外毒素PLD,（鞘磷脂酶）,PLD4,100%4,_,白喉毒素tox基因比对,选取,13株,C.diphtheriae的白喉tox基因和,15株,C.ulcerans的tox基因进行比对。

文献中白喉毒素tox引物,Target microb,序列（5-3）,Location,产物长度(bp),C,Diphtheriae2,And C,ulcerans,TGAAACCCGTGGAAAACG,AGACTCTATCTTTGTCTTAG,CGTGTCAGGCGATCAGTAGGT(,diphtheriae,),CTCATTGTCATGCATAAATCTTGAT(,ulcerans,),576-593,713-732,643-663,666-690,156,C,Diphtheriae for tox A subunit16,GAAAACTTTTCTTCGTACCACGGGACTAA,ATCCACTTTTAGTGCGAGAACCTTCGTCA,118-137,338-366,248,C,Diphtheriae for tox B subunit16,ATACTTCCTGGTATCGGTAGC,CGAATCTTCAACAGTGTTCCA,991-1011,1267-1287,297,白喉毒素又A,B2个亚基组成，但某些菌株只存在一种亚基，另一亚基丢失的情况，建议针对这两个亚基分别设计1对引物检测，方能对菌株是否含有白喉毒素进行准确定性。

鞘磷脂酶PLD基因比对,选取10株C.ulcerans的PLD基因进行比对,选取17株,C.pseudotuberculosis的PLD基因进行比对,文献中PLD引物,Target micro,序列（5-3）,Location,产物长度(bp),C.pseudotuberculosis4,ATAAGCGTAAGCAGGGAGCA,ATCAGCGGTGATTGTCTTCC,506-525,689-708,203,参考文献,1 Burhan Cetinkayaa,*,Murat Karahana,Eray Atila,et al.Identification of Corynebacterium pseudotuberculosis isolates from sheep and goats by PCRJ.Veterinary Microbiology 88(2002)7583.,2 Fabiola Mancini,Monica Monaco,Marco Pataracchia,et al.Identification and molecular discrimination of toxigenic and nontoxigenic diphtheria Corynebacterium strains by combined real-time polymerase chain reaction assaysJ.Diagnostic Microbiology and Infectious Disease 73(2012)111120.,3 Fabricia P.Pimenta,Gisele A.M.Matias,Gabriela A.Pereira,et al.A PCR for dtxR gene:Application to diagnosis of non-toxigenic and toxigenic Corynebacterium diphtheriaeJ.Molecular and Cellular Probes 22(2008)189192.,4 Luis G.C.Pacheco,Roberta R.Pena,Thiago L.P.Castro,et al.Multiplex。