细胞器的光镜观察.docx

细胞器的光镜观察［实验用品］1. 材料：洋葱鳞茎、口腔上皮细胞、盖片培养的单层动物细胞、蟾蜍肾脏切片；猫或兔的脊 神经节切片、马蛔虫子宫切片2. 器具：光学显微镜、载玻片、盖玻片、小镊子、吸管、牙签、吸水纸、擦镜纸、剪刀、恒 温水浴箱、小培养皿、小染色缸、大平皿3.试剂：中性红-詹纳斯绿染液、6mmol/l ph6.5磷酸缓冲液、m-缓冲液、2% triton、x-10 0 液、 3%戊二醛、考马斯亮蓝染液、 ph7.0，1/15 mol/l 磷酸缓冲液［实验内容与方法］一、线粒体的活体染色（一）原理 线粒体是细胞内的一个重要的细胞器，是细胞内能量贮存和供能的主要场所詹纳斯绿是线 粒体的专一活体染色剂线粒体内含有细胞色素氧化酶，当用詹纳斯绿（janus green b）进 行染色时，细胞色素氧化酶能与詹纳斯绿发生氧化反应，线粒体呈现为蓝绿色，而周围的细 胞质则被还原成无色的区域若用中性红-詹纳斯绿混合染色，可使线粒体显示更为清楚二）试剂配制1. 1:15 000中性红水溶液：中性红5mg溶于75ml蒸馏水中2. 1%詹纳斯绿b染液：称取1g詹纳斯绿b溶于100ml蒸馏水中，稍加热（30〜45七）使之 快速溶解，用滤纸过滤，即为1%原液,装入棕色瓶备用。

为了保持其充分的氧化能力，最好 是临用前现配3. 1%中性红溶液：称取0.5g中性红溶于50ml蒸馏水中4. 中性红一詹纳斯绿染液：a 液：将 6 滴 1% 詹纳斯绿水溶液加入到 10ml 无水乙醇中，然后再加入 2ml 1:15 000 中性 红水溶液，并用黑纸包好贮于冰箱中b液：在10ml无水乙醇中，加入40〜60滴1%中性红溶液将a液和b液混合在一起，即成中性红-詹纳斯绿混合染液此液临用前配制三）方法1. 人口腔上皮细胞线粒体的活体染色及观察（1 ）制片：将清洁的载玻片平放在桌上，然后在载玻片的中央滴 2~3 滴中性红--詹纳斯绿 染液用牙签的宽头轻轻地刮自已口腔壁的内侧 （刮的范围可稍大些，此步仅作为清洁取 材面），将刮出物连牙签一起弃之然后用另一支牙签宽头在原位刮取口腔上皮细胞于载玻 片染液中混匀 （由于最表面的粘膜上皮细胞大都已衰老，代谢不旺盛，线粒体少，刮时可稍 重些，尽量取较深部的粘膜，但以不刮出血为限），盖上盖玻片，染色2〜3 分钟2）观察：高倍镜下可见口腔上皮细胞的细胞质中，散在一些被染成亮绿色的粒状和短棒状 的颗粒，即为线粒体2. 植物细胞线粒体的活体染色及观察（1） 制片：将清洁的载玻片平放在桌上，然后在载玻片的中央滴 2 滴中性红-詹纳斯绿染液。

切开洋葱鳞茎，用镊子轻轻撕下洋葱鳞片的内侧面膜状的半透明内表皮，用剪刀剪下一小块（4mm2大小），放在载玻片的染料中，使其展开，染色20〜30分钟2） 装片：在染色的载玻片上，用吸管吸取蒸馏水，滴于染色的载玻片上，使染液冲淡盖盖玻片，用吸水纸吸去多余的水分（加盖玻片时注意避免气泡出现）3）观察：将做好的临时玻片标本，先用低倍镜观察，找到细胞后，转用高倍镜观察，可见洋葱表皮细胞胞质中含有液泡，细胞核位于细饱的中央或被挤至边缘，细胞质中有被染成蓝 绿色的小颗粒，此即线粒体二、细胞骨架的显示和观察（一）原理用一定浓度的 triton，x-100 液（聚乙二醇辛基苯醚）处理洋葱鳞茎表皮细胞和动物细胞， 可破坏洋葱鳞茎表皮细胞的细胞壁及洋葱鳞茎表皮细胞和动物细胞内的蛋白质，而细胞骨架 系统的蛋白质被保留下来，经戊二醛固定处理和考马斯亮蓝染色后，能在光镜下观察到细胞 骨架的结构本实验显示的细胞骨架成分是以微丝为主组成的张力纤维二）试剂配制1. 6mmol/l ph6.5 磷酸缓冲液：甲液：nah2po4^2h2o, 0.938g溶于蒸馏水中，最后稀释至1 000ml乙液：na2hpo4 ・12h2o, 2.15g加蒸馏水溶解，最后加水至1 000ml。

取甲液68.5ml,乙液31.5ml加蒸馏水100ml即成6mmol/l ph6.5的磷酸缓冲液2. m-缓冲液（10x原液）：咪唑34.04g，氯化镁（mgcl2£h20）1 020mg，egta （乙二醇双醚四乙酸）3 800mg，edta （乙二胺四乙酸）290mg,巯基乙醇780mg （0.7ml）蒸馏水加至1000 ml使用时，取25 ml （10x原液）加225 ml蒸馏水稀释3. 2%triton, x-100 液：取 22ml triton, x-100 液加 m-缓冲液至 100ml4. ph7.0, 1/15mol/l 磷酸缓冲液（1） 原液： 甲液：磷酸二氢钠（nah2po4） 4.6g加双蒸馏水至500ml，加氯仿少许置4°C冰箱中保存 乙液：磷酸氢二钠(na2hpo4) 1.9g加双蒸水至500ml，加氯仿少许置4°C冰箱中保存2)使用液：甲液28ml，乙液72ml加双蒸水至1 000ml，加氯仿少许常温下备用5. 3%戊二醛：取 3ml 25%戊二醛 ph7.0，1/15mol/l 磷酸缓冲液至 100ml6. 0.2考马斯亮蓝染液：考马斯亮蓝r250 0.2g，甲醇46.5ml，冰醋酸7ml,蒸馏水46.5ml。

三)方法1. 动物细胞骨架的显示方法(1)无菌条件下，在25 ml培养瓶中放入清洁无菌的盖玻条，然后接种3 ml左右的细胞 悬液，盖紧瓶塞，37C恒温箱内培养24小时2) 取出盖玻片条，浸入装有6mmol磷酸缓冲液的小瓶中5〜10分钟3) 用吸管吸弃6mmol/l磷酸缓冲液，加入2% triton, x-100液，盖紧瓶塞，置37C恒温箱中处理 20~30 分钟⑷ 用吸管吸弃triton, x-100液，加入m-缓冲液，轻轻洗涂细胞3次，每次3分钟5)用吸管吸弃m-缓冲液，加入3%戊二醛溶液固定8〜10分钟⑹ 吸弃固定液，用6mmol/l磷酸缓冲液反复冲洗3次，每次10分钟7) 取出盖玻片条，放在小培养皿中，加入0.2%考马斯亮蓝染液数滴，染色30分钟以上8) 用蒸馏水冲洗玻片，空气干燥9) 观察：光镜下可见细胞中分布着许多被染成蓝色的网络状结构，此即细胞骨架图 3-1 细胞骨架图 3-2 光镜下高尔基复合体三、永久制片标本的观察由于不同的细胞器需用不同的染色方法才能显示出来，故要在不同的标本中观察一）高尔基复合体电镜下所见的高尔基复合体是由小囊泡、扁平囊泡、大囊泡三部分组成，但在光镜下所见的 却与此截然不同，呈点状或螺旋状。

观察麻雀小脑、兔或猫的脊神经节切片标本，低倍镜下观察，可见到许多大小不等、被染成 黄色的圆形神经节细胞，该细胞中央有一不着色呈空泡状的圆形细胞核可作为该细胞的标志 选择神经节细胞较多的部位，转换高倍镜或油镜仔细观察，可清晰看到细胞中央圆形、空泡 状细胞核，有的核内可见1~2 个发亮的呈淡黄色的核仁细胞质中散在许多棕黑色颗粒状 或短线状的结构，就是高尔基复合体高尔基复合体在细胞内的位置一般集中于细胞核外的 某一区域，但在镜下所见的神经节细胞中高尔基复合体却多半围绕在整个细胞的周围在视 野中也可以看到没有经过核的切面，该细胞内高尔基复合体就好象散在整个细胞中 （二）线粒体1. 将蟾蜍肾脏切片置于低倍镜下观察，视野中可见到许多圆形或椭圆形的中肾小管横切面， 每一中肾小管的中央为管腔，管壁由紧密排列的单层上皮细胞组成，管壁细胞之间界限不甚 清楚，但可根据核的位置大致确定细胞的范围转换高倍镜或油镜观察，可见细胞核呈圆形， 浅蓝色，内有一深染的核仁，核周围的细胞质中有许多蓝黑色颗粒或线状的结构，即为线粒 体2. 在蛙肝脏组织的玻片标本上，横切面呈三角形和深蓝色首先在低倍镜下找到蛙的肝脏 组织的横切面，调清视野，然后转换到高倍镜或油镜观察。

可以看到细胞的界限不太清楚， 细胞中央不着色的部位或浅染区是细胞核，内有1 个或多个核仁在细胞核周围的细胞质 中有许多染成深蓝色的线状、短棒状或颗粒状的结构，这就是线粒体三）中心粒观察马蛔虫的子宫横切片在低倍镜下观察，可以看到宫腔内有许多处于不同分裂时期的受 精卵，外围有一层厚的受精膜（注意不要误以为受精卵的细胞膜），膜内为大的围卵腔寻 找其受精卵处于有丝分裂中期的细胞，然后换高倍镜观察可在细胞两极看到明显的中心体 每个中心体含有一个被染成深蓝色的小粒，称为中心粒，在中心粒周围有一团较致密的物质， 称为中心球，中心粒和中心球合称中心体在中心体的外围隐约可见放射状的星射线两个 中心粒之间丝状的结构，称纺锤体图 3-1 脊神经节细胞高尔基体 图 3-2 肾小管上皮细胞线粒体1.高尔基体 2.细胞核 3.细胞膜 1.肾小管 2.细胞核 3.核仁 4.线粒体图 3-3 马蛔虫受精卵细胞分裂中期（示中心体）上 光镜图； 下 电镜图1.中心体 2.卵膜 3.染色体 4.围卵腔。