lasik术后兔角膜及角膜成纤维细胞生物力学性能和生物学行为的研究.pdf

太原理工大学 博士学位论文 LASIK术后兔角膜及角膜成纤维细胞生物力学性能和生物学行为 的研究 姓名：王晓君 申请学位级别：博士 专业：@ 指导教师：陈维毅 @ 太原理工大学博士研究生学位论文 I LASIK 术后兔角膜及角膜成纤维细胞生物力学性能 和生物学行为的研究 摘 要 近视眼是目前全球发生率最高、范围最广的严重公共卫生问题，世界 卫生组织（WHO）已将近视眼的防治列入全球防盲计划准分子激光原位 角膜磨镶术(laser in situ keratomileusis, LASIK)是目前广泛开展且临床疗效 明确的治疗近视的角膜屈光手术，但是近年来因过度切削导致术后继发性 圆锥角膜的病例也屡有报道 LASIK 术后角膜层变薄，在相同的眼内压作用下，角膜所受的应力明 显增大，角膜成纤维细胞的力学环境发生了变化，从而影响其生长、增殖、 凋亡及其分泌的胶原等细胞外基质成分本文通过对成年新西兰白兔兔眼 行不同切削量的 LASIK 术，使其角膜及角膜成纤维细胞处于不同的力学环 境，并于术后不同时间从细胞－组织水平，结合生物学、病理学、生物力 学等方法和手段，系统、全面地研究了 LASIK 术后兔眼角膜及角膜成纤维 细胞生物力学性能及生物学行为的改变，探索术后角膜的恢复机理和圆锥 角膜的成因，为临床治疗近视眼提供有力的理论依据和指导。

主要工作内 容和结论如下： 1. 选取成年新西兰白兔 80 只，随机分成四组，A：正常对照组、B： 单纯揭瓣组、C：50％组、D：30％组B、C、D 组行 LASIK 术，C、D 组 揭起角膜瓣，激光打磨基质层，直至残留的基质床厚度分别为整体角膜厚 度的 50％、30％，B 组只揭起角膜瓣，不打磨基质层将上述四组模型分 别随机分成两大组，分别于术后一周、一月处死实验动物，一部分进行了 组织实验，另一部分进行了细胞实验 太原理工大学博士研究生学位论文 II 2. 制备了上述各组动物模型的角膜条带，进行单向拉伸实验，检测角 膜组织的生物力学特性， 并采用标准三参量固体模型和五参量广义 kevin 模 型拟合实验数据，求解各组角膜的切线弹性模量及粘弹性系数研究发现： （1）各组角膜的切线弹性模量随应力水平的增大而增大，且当应力水 平达到 0.03MPa 时，术后一周 D 组角膜的切线弹性模量显著低于其它各组 （p<0.05） ；术后一月各组间角膜的切线弹性模量无统计学差异，30%组显 著高于其一周组（p<0.05） ，其余组一周、一月间无统计学差异 （2）LASIK 术后一周，同 A 组相比，B 组和 C 组角膜的瞬时弹性模 量及稳态弹性模量均无显著差异，表明当切削后基质床残留大于等于 50% 时角膜抵抗变形的能力无显著改变；D 组角膜瞬时弹性模量同其它组相比 无明显差异，但稳态弹性模量显著降低（p<0.05） ，同时三参量模型中的粘 性系数明显降低（p<0.05） ，说明当切削基质层使基质床残留低至 30%时， 角膜稳态时抵抗变形的能力明显减弱，而且角膜粘性降低，易流动变形。

（3）LASIK 术后一月，各组角膜的瞬时弹性模量、稳态弹性模量及粘 性系数均无显著差异与术后一周相比，D 组角膜稳态弹性模量及粘性系 数显著提高（p<0.05） ，说明 D 组角膜术后一月抵抗变形能力回升，粘性流 动降低其余各组角膜的粘弹性性能一周、一月之间无明显差异 （4）五参量广义 kevin 模型对实验曲线的拟合效果明显优于标准三参 量固体模型，但二者所得结论一致 3. 采用免疫组化和酶联免疫吸附剂法，检测各组角膜中基质金属蛋白 酶(MMP-2)、 组织金属蛋白酶抑制剂(TIMP-2)及转化生长因子(TGF-β1)的含 量研究发现： （1）正常组及不同手术组角膜组织均有 MMP-2、TIMP-2 及 TGF-βl 的表达，免疫定位主要存在于角膜上皮层，浅基质层也有零星表达 （2）术后一周，角膜组织中 MMP-2 和 TGF-βl 的表达随切削量增加而 太原理工大学博士研究生学位论文 III 升高，D 组与其他组相比有显著差异（P<0.05） ；手术后一月均下降，但各 组之间无统计学差异 （3）术后一周 TIMP-2 的表达随切削量的增加而略有降低，术后一月 又有所回升，各组间无统计学差异。

说明角膜在创伤修复早期 TGF-βl 分泌增多，刺激 MMP-2 表达增强； 之后 TIMP-2 的含量升高，抑制了 MMP-2 的表达，一月后达到平衡状态 4. 术后一月提取各组原代角膜成纤维细胞，进行微管吸吮实验，结合 经典半无限体力学模型，把细胞假设成为均质的弹性体和三参数粘弹性体， 检测了各组角膜成纤维细胞的生物力学特性研究发现： （1）LASIK 术后一月，角膜成纤维细胞的切线弹性模量随切削量的增 加而降低，D 组同 A 组相比有显著差异（P<0.05） ，其余各组之间无统计学 差异 （2）粘弹性蠕变实验表明，术后一月 D 组角膜成纤维细胞的瞬时弹性 模量、 平衡弹性模量及粘性系数与 A 组和 B 组之间均有显著差异 （P<0.05） 表明当角膜基质层残留低至 30%时，角膜成纤维细胞抵抗变形的能力明显 下降，且易流动变形 5. 提取正常组的角膜成纤维细胞， 传代培养后采用 Flexcell 装置进行同 频率（0.1Hz） 、不同幅度（5％、10％、15％）的周期性拉伸实验，每组均 设有静态对照组，并分别于拉伸后 6 小时、24 小时提取细胞上清，ELISA 法检测 MMP-2、TIMP-2 及 TGF-β1 的含量。

研究发现： （1）当周期性拉伸幅度为 5%时，拉伸 6 小时、24 小时后，细胞上清 中 MMP-2、TIMP-2 及 TGF-βl 的含量与静态对照组相比均无统计学差异 （2） 当拉伸幅度为 10%时， 拉伸 6 小时后细胞上清中 MMP-2、 TIMP-2、 TGF-βl 的含量与静态对照组相比无统计学差异，拉伸 24 小时后 MMP-2 的 含量显著升高（P<0.05） 太原理工大学博士研究生学位论文 IV （3） 当拉伸幅度为 15%时， 拉伸 6 小时后细胞上清中 MMP-2、 TIMP-2、 TGF-βl 的含量与静态对照组相比仍无统计学差异， 拉伸 24 小时后 MMP-2、 TGF-βl 含量均显著升高（P<0.05） ，TIMP-2 含量显著降低（P<0.05） 说明受到适当的应力刺激后，MMP-2、TIMP-2 和 TGF-βl 相互作用，共 同调节角膜细胞的生物学行为 关键词： LASIK， 角膜，角膜成纤维细胞， 生物力学性能，细胞因子 太原理工大学博士研究生学位论文 V THE BIOMECHANICAL PROPERTIES AND BIOLOGY BEHAVIOR OF RABBIT CORNEA AND CORNEAL FIBROBLASTS AFTER LASIK SURGERY ABSTRACT Myopia is the most pervasive and serious public hygiene problem all over the world. It has been placed on the agenda by world health organization to prevent blindness worldwide. Laser in situ keratomileusis (LASIK) is a widely used ophthalmic technique in refractive surgery. But complications especially keratoconus are bound to occur when a surgical procedure is performed with increasing frequency. The cornea will be subjected to greater stress under the same intraocular pressures (IOP) when it becomes thinner after LASIK surgery. The mechanical environment of corneal fibroblasts will also change, which can influence many aspects of cellular behaviors such as cell growth, proliferation, apoptosis as well as extra cellular matrix in turn. In this study, LASIK surgeries with different ablation depth were performed on adult New Zealand rabbits, which put the corneal tissue and fibroblasts to varied mechanical environment. Effects of mechanical stimulation on the biomechanical properties of cornea and fibroblasts and their biology behavior were investigated at different surgical stages from cell and tissue level. Biology, pathology and biomechanics methods and techniques were used in our research. Our aim is to explore the mechanism of corneal recovery and keratoconus after surgery. It will provide the valuable theoretical evidence and powerful guidance for clinical therapy. The main work and conclusions are as follows: 太原理工大学博士研究生学位论文 VI 1. Eighty Zealand white rabbits were divided into A, B, C and D groups at random. Group A was used as control，Rabbits in groups B、C and D were performed LASIK. After mading a hinged flap with an incision, Groups C and D were laser ablated with residual stroma bed of the cornea 50% and 30% respectively, Group B were only made a hinged flap. The rabbits were sacrificed at one week and one month respectively. 2. Strip specimens extracted from fresh rabbit corneas were subjected to uniaxial tension to determine their biomechanical 。