PCR技术的原理与应用.ppt

PCR技术的原理 与应用（二）PCR中常见的问题 解决办法PCR产物的电泳检测时间 v 一般为48h以内，有些最好于当日电泳检测 ，大于48h后带型不规则甚致消失 PCR反应有哪些关键环节？ v①模板核酸的制备，②引物的质量与特异性 ，③酶的质量 ④PCR循环条件寻找原因亦 应针对上述环节进行分析研究 模板最容易出现的问题v①模板中含有杂蛋白质，②模板中含有Taq酶抑制 剂，③模板中蛋白质没有消 化除净，特别是染色体 中的组蛋白，④在提取制备模板时丢失过多，或吸 入酚⑤模 板核酸变性不彻底在酶和引物质量好 时，不出现扩增带，极有可能是标本的消化处 理， 模板核酸提取过程出了毛病，因而要配制有效而稳 定的消化处理液，其程序亦应 固定不宜随意更改 PCR引物常见的问题v引物：引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称，是PCR失败 或扩增条带不 理想、容易弥散的常见原因有些批号的引物合成质量有 问题，两条引物一条浓度 高，一条浓度低，造成低效率的不对称扩增， 对策为：①选定一个好的引物合成单 位②引物的浓度不仅要看OD值 ，更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳，一定要有引物条带出现，而且 两引物带的亮度应大体一致，如一条引物有条带，一条引物无条带，此 时做PCR有可能失败，应和引物合成单位协商解决。

如一条引物亮度高 ，一条亮度低，在稀释引物时要平衡其浓度③引物应高浓度小量分装 保存，防止多次冻融或长期放冰箱冷藏部分，导致引物变质降解失效 ④引物设计不合理，如引物长度不够，引物之间形成二聚体等 酶的问题v 酶失活：需更换新酶，或新旧两种酶同时 使用，以分析是否因酶的活性丧失或不够而 导致假阴性需注意的是有时PCR失败是由于 忘加了Taq酶 Mg2+浓度v ：Mg2+离子浓度对PCR扩增效率影响很大 ，浓度过高可降低PCR扩增的特 异性，浓度 过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失 败而不出扩增条带 PCR反应体积v通常进行PCR扩增采用的体积为20ul、30ul 、50ul或100ul，应用多 大体积进行PCR扩 增，是根据科研和临床检测不同目的而设定 ，在做小体积如20ul 后，再做大体积时，一 定要模索条件，否则容易失败 变性温度对PCR的影响v变性对PCR扩增来说相当重要，如变性温度低，变 性时间短，极有可能出现假阴性;退火温度过低，可 致非特异性扩增而降低特异性扩增效率；退火温度 过高影响引物与模板的结合而降低PCR扩增效率 有时还有必要用标准的温度计，检测一下扩增仪或 水溶锅内的变性、退火和延伸温度，这也是PCR失 败的原因之一。

靶序列变异v 如靶序列发生突变或缺失，影响引物与模 板特异性结合，或因靶序列某 段缺失使引物 与模板失去互补序列，其PCR扩增是不会成 功的 PCR出现假阳性的原因？ v假阳性： 出现的PCR扩增条带与目的靶序列条带一致，有时其条带更整齐， 亮度更高 引物设计不合适：选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性，因而在进行 PCR扩增时，扩增出的PCR产物为非目的性的序列靶序列太短或引物太短， 容易出现假阳性需重新设计引物 靶序列或扩增产物的交叉污染：这种污染有两种原因：一是整个基因组或大 片段的交叉污染，导致假阳性这种假阳性可用以下方法解决：操作时应小心轻 柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外除酶及不能耐高温的物质外， 所有试剂或器材均应高压消毒所用离心管及样进枪头等均应一次性使用必要 时，在加标本前，反应管和试剂用紫外线照射，以破坏存在的核酸二是空气中 的小片段核酸污染，这些小片段比靶序列短，但有一定的同源性可互相拼接， 与引物互补后，可扩增出PCR产物，而导致假阳性的产生，可用巢式PCR方法 来减轻或消除 非特异性扩增带出现的原因vPCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时 出现特异性扩增带 与非特异性扩增带。

非特异性条带的出现，其原因： 一是引物与靶序列不完全互补、 或引物聚合形成二聚体二是Mg2+离子 浓度过高、退火温度过低，及PCR循环次数 过多有关其次是酶的质和 量，往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶 则不出现，酶 量过多有时也会出现非特异性扩增非特异性扩增带出现的对策（一）v其对策有：必要时重新设计引 物减低酶量或调换另一来源 的酶降低引物量，适当增加模板量，减少循环次 数适当 提高退火温度或采用二温度点法(93℃变性，65℃左右退火 与延伸) 非特异性扩增带出现的对策（二）v采用热启动PCR：v把PCR混合物在显著低于Tm值的温度下作哪怕短暂的保温，也可能产 生引物二聚体和非特异性配对热启动PCR则可以大大减少这些麻烦 其目标是在第一个循环中等温度升到超过反应物的Tm值后才允许反应中 的一两种关键成分进入反应例如在复盖有矿物油的小试验中，所有反 应管的一种公共成分（如Taq酶）可以先不加，而到第一个循环的变性 阶段温度超过80 ℃以后再加v最近有一种热启动的方法是在加入Taq DNA聚合酶前先在管中加入其单 克隆抗体（Clonetech 公司的Taq Start Antibody，或者ToYoBo公司的Kod PlusDNA聚合酶），在温度升高到将中和抗体变性失活之前，抗体阻遏 聚合酶的活性，防止反应开始。

非特异性扩增带出现的对策（三）v嵌套式和半嵌套式PCR对于减少或消除不需要的产物同时提高灵敏度经常是很 成功的首先在常规调价下用第一套跨越目的DNA片段的引物扩增，假象产物 经常会与引物中的一条或两条配对，但其内部却是无关序列接着对一部分反应 物－产物混合物进行新一轮扩增，采用的引物与第一对引物内侧的序列配对，在 这一轮扩增中只有真正的产物被扩增这种办法即使在目的产物开始用EB染色 检测不到而且有假象带时也常常获得成功半嵌套式PCR，只第二条引物在目 的片段一端的内侧，也同样有效在基因步行或企图进行5‘或3’端RACE时，由 于只有一条引物内部的序列是已知的，经常需要作这种变动v采用嵌套式PCR方法，第一、二轮扩增在第20个循环左右终止而不是象通常的 在第30－35个循环终止会获得更好的结果，这样做减少了产生不需要的高分子 量带和成片产物的机会嵌套式PCR极端敏感，在106基因组DNA背景中一个拷 贝的病毒基因也能检测到v第二种形式的假象，即所谓的跳跃PCR，可能不能用嵌套式PCR消除一些延 伸不完全的产物可能偶尔与相邻的DNA片段，也许是相似的基因成分重新配对 ，这样会产生不需要的产物。

在这种情况下，一条或两条引物内侧的序列仍旧存 在，但扩增产物的大小不同出现片状拖带或涂抹带 v PCR扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带其原因 往往由于酶量过多或酶的质量 差，dNTP浓度过高，Mg2+浓 度过高，退火温度过低，循环次数过多引起其对策有：减 少酶量，或调换另一来源的酶②减少dNTP的浓度适当 降低Mg2+浓 度增加模板量，减少循环次数 克隆PCR产物的最优条件是什么？ v最佳插入片段：载体比需实验确定1：1（插入片 段：载体）常为最佳比，摩尔数比1：8或8：1也行 应测定比值范围连接用5ul 2X连接液buffer, 50ng质粒DNA,1Weiss单位的T4连接酶，插入片段 共10ul室温保温1小时，或4℃过夜在这2种温 度下，缺T-凸出端的载体会自连，产生蓝斑室温 保温1小时能满足大多数克隆要求，为提高连接效 率，需4℃过夜v使用TA克隆方法或平端连接方法（利用pUC19载体上 的SmaI位点） PCR产物是否需要用凝胶纯化？ v如凝胶分析扩增产物只有一条带，不需要用 凝胶纯化如可见其他杂带，可能是积累了 大量引物的二聚体少量的引物二聚体的摩 尔数也很高，这会产生高比例的带有引物二 聚体的克隆，而非目的插入片段。

为此需在 克隆前做凝胶纯化 标准的PCR反应体系： v10×扩增缓冲液 10ul 4种dNTP混合物 各200umol/L 引物 各10～100pmol 模板DNA 0.1～2ug Taq DNA聚合酶 2.5u Mg2+ 1.5mmol/L 加双或三蒸水至 100ul PCR出现smear可能的原因（1） v都是由于产生非特异性扩增所致，逐个验证： 1、酶、引物、模板浓度太大，可以减少这几个组分的v 用量 2、温度太低，升高退火温度，可以先做一个不同温度v 的预实验或者选用降落PCR 3、引物特异性不好，引物特异性的好坏可以在ncbi比v 对得知关于引物是否合成的好，可以在DHPLC上v 看一下，80度全变性的情况下一条带就可以了如v 果合成的不好，产物自然不特异了 Taq酶只要有v 引物结合模板的情况下，就会迅速扩增DNA，所以v 如果没有特异性引物下，很容易产生smear 4 、Mg2+浓度的问题，这个成分对产物的特异性是非常v 重要的，可以做一梯度优化一下； PCR 出现Smear的可能原因（2）v假定使用了比较好的Taq酶，且引物没有出 现问题，考虑如下几点： 1、模板是否过量？ 2、退火温度是否可降高1－2度？ 3、Mg2＋的浓度控制在1.5mM? 4、循环数是否过多？ PCR 出现Smear的可能原因（3）v由于酶量过多或酶的质量差，dNTP浓度过 高，Mg2+浓度过高，退火温度过低，循环次 数过多引起。

其对策有： ①减少酶量，或调换 另一来源的酶 ②减少dNTP的浓度 ③适当降低Mg2+浓度 ④增加模板量，减少循环次数 v PCR 高保真酶推荐：vPE公司（ABI）Parken－Elmer DNA聚合酶vTakaRa公司的Prime StarvToYoBo公司的Kod－PlusPCR产物成片的原因?v增加循环数可以增强反应物不足时的反应，但这样 会导致产生假阳性带以及富含单链DNA的高分子量 成片产物如果起始模板的量太大，就象企图再扩 增第一次PCR产物时经常遇到的那样，同样的产物 成片现象也可能在正常条件下出现总的规则是如 果在凝胶上见得到条带，只能用1l第一次PCR产 物的1：104到1：105稀释物作为模板进行第二轮 PCR很少或没有检测到产物的原因v如果已经调整了Mg2＋浓度、缓冲液的pH值和循环产物，而且也增加了循环数， 尝试过了较低的退化温度和TD PCR，但在EB染色的凝胶上还是看不到产物（聚 丙烯酰胺凝胶比琼脂糖凝胶要敏感一些），而阳性对照表明试剂没有问题，下一 步该怎么办？延长起始的变性时间和（或）提高温度能增加模板DNA完全变性 的可能，以提供最大数量的引物配对位点。

这一可选步骤的标准条件是95C变 性5分钟，有可能扩增发生了，只是效率不高，如果这样，可通过对干凝胶或印 迹的杂交来检测产物用同一套引物或者最好用嵌套式引物进行第二次扩增，有 可能得到特异产物，这时必须用第一次PCR产物的从1：100到1：10000的一系 列10倍稀释物v很少或没有产物可能提示DNA样品中存在抑制物许多PCR的抑制物已被描述 过，它们包括离子性去污剂（如SDS）、酚、肝素等通过把原PCR混合物与 已知阳性对照模板（被证明可以扩增）的稀释物混合的方法可以验证制备的模板 中是否有抑制物若有，重新抽提、乙醇沉淀和（或）离心超滤有可能解决问题 纯化模板过程中残留的蛋白酶K可能会降解Taq DNA聚合酶，但它在95 C保 温5分钟很容易变性。