凝胶排阻ppt课件.ppt

第四章 凝胶〔排阻〕层析中国医科大学实验技术中心中国医科大学实验技术中心孙晋民孙晋民 排阻层析(exclusion chromatography)，亦称分子筛层析(molecular sieve chromatography)、凝胶过滤(gelfiltration)凡是利用生物大分子的相对分子质量(relativemolecular mass，Mr)差别进展层析分别的方法，均称之为排阻层析用于排阻层析的分别介质称为排阻层析介质在20世纪60年代初就开场运用凝胶介质分别生物大分子例如，用淀粉或者琼脂糖作为电泳支持物分别血清中的蛋白质，凝胶在其中起分子筛作用后来人们将凝胶制成球形微珠，作为液相层析分别介质，用于分别生物大分子，并获得宏大胜利如今运用的凝胶层析介质的用途远远超出了电泳分别介质的范畴，已成为分别纯化生物大分子最重要的分别介质之一，也是作为合成带有配基的层析介质运用最广泛的一种载体凝胶层析介质主要是以葡聚糖、琼脂糖、聚丙烯酰胺等为原料，经过特殊工艺合成的层析介质目前已成为生物化学、分子生物学和生物制药在研讨和消费中必不可少的分别介质 第一第一节 概述概述第二节 凝胶层析原理 一、根本原理 凝胶类层析介质是一种在球体内部具有大孔网状构造凝胶微粒，不同大小的网状孔径像筛子一样，可以把大小不同的生物大分子按一定的顺序进展分别，好似“目数〞不同的普通筛子一样把大小不同颗粒分级筛分。

但是排阻层析与普通筛分的原理不同，排阻层析是按生物分子分子量的大小排序进展筛分的 相对分子质量大的生物分子由于不能进入或不能完全进入凝胶内部的网状孔，沿着凝胶颗粒间的空隙或大的网状孔经过，大分子相对于小分子迁移的途径近，在柱内的停留时间短，保管值小，所以在层析过程中迁移率最快，走在小分子的前面，先从柱中流出； 分子量小的分子由于可以进入凝胶内部的网状孔，沿着凝胶颗粒不同大小的网状孔流过，相对于大分子迁移的途径长，在柱内的停留时间长，保管值大，所以在层析过程中迁移率最慢，走在大分子的后面，后从柱中流出 样品中分子量大小不同的各种分子在流过凝胶内部网状孔时就遭到凝胶介质排阻效应，也称为分子筛效应，将它们一个一个分别，从而到达分别的目的普通筛分是大颗粒不能经过筛子的筛孔而被截留在筛板的上面，小颗粒可以经过筛孔所以普通筛分与凝胶层析筛分的原理是不一样的排阻层析分别的根本原理如下图 凝胶层析介质分别的分子主要分3部分第一部分是全排阻分子，也可称之为上限分子量，不能起筛分作用的大分子第二部分是部分浸透分子，称为分别分子，是凝胶介质有效分别的分子。

第三部分是全浸透分子，称之为下限分子量，是不能起筛分作用的小分子  从图可以看出，A-B之间为该凝胶的有效分别范围，可分别相对分子质量范围是1000～100000，高于相对分子质量为100000的是全排阻分子，低于相对分子质量为1000的是全浸透分子 凝胶层析的分别范围表示图二、参数的表示方法及其意义二、参数的表示方法及其意义1.柱床体积 凝胶层析介质经溶胀、装柱、沉降、体积稳定后，所占层析柱内的总体积，称为柱床体积或床体积，以Vt(total volume)表示，单位为ml2.外水体积 存在于柱床体积内凝胶颗粒之外、颗粒之间的空隙所占有的那一部分水相体积或溶剂体积，称之为外水体积或外体积，以Vo(outer volume)表示，单位为m13.内水体积 是凝胶吸水溶胀后，存在于凝胶颗粒内所占有的那一部分水相体积或溶剂体积，称之为内水体积或内体积以Vi(inner volume)表示，单位为m1 4.凝胶体积 是凝胶颗粒本身的体积，也就是床体积减去外水体积和内水体积后所占有的体积，称为胶体积或称干胶体积,以Vg(gel volume)表示，单位为m1。

l5.洗脱体积 自加样液时开场，到洗脱组分浓度最大时出现的峰(洗脱峰峰顶)为止，所搜集的体积，以Ve(elution volume)表示，单位为m1l计算法：根据层析柱体积计算总体积可用以下公式表示l　　　 Ｖt=πr2h l干凝胶用量〔克〕＝ πr2h ／膨胀度〔床体积／克干胶〕三、参数之间的关系三、参数之间的关系丈量法1.床体积与Vo，Vi，Vg之间的关系式是： Vt=Vo+Vi+Vg (1-1)2.洗脱体积与Vo，Vi的关系式为： Ve=Vo+KdVi (1-2) 式中Kd-样品组分在流动相和固定相之间的分配系数，也可以视为相对分子质量不同的溶质在凝胶颗粒的内部和外部的分配系数它只与被分别物质相对分子质量的大小、凝胶颗粒空隙和网状孔径大小有关，与层析柱的长短和粗细无关Kd可以经过实验获得3.Kd与体积之间的关系 可以将式(1-2)变换一下，即可得到Kd与体积之间的关系式：(1-3) Ve – Vo Vi 式中 Ve-实验测得的实践洗脱体积 可用不被凝胶滞留的大的相对分子质量组分测得，通常用相对分子质量在2×106的蓝色葡聚糖-2000测定，可以经过干胶的吸水量(每克干胶所吸附水的毫升数)求得。

对于一定条件的凝胶层析柱来说，只需经过实验得知某一组分的洗脱体积Ve，就可以计算出Kd值 以上关系可以经过图2表示Kd=四、四、KdKd的几种判别的几种判别 在凝胶柱层析过程中，Kd可以有以下几种情况：1.Kd=0时，Ve=Vo 对于完全不能进入凝胶内部的大分子(全排阻)，其洗脱体积就等于外水体积2.Kd=1时，Ve=Vo+Vi对于完全可以进入凝胶内部的小分子(全浸透)，其洗脱体积就等于外水体积和内水体积之和  由此可见，对于某一凝胶介质，假设在层析过程中有两种全排阻的大分子，即Kd=0，虽然它们在分子量之间的差别很大，但由于它们曾经超出了该凝胶质的所能分别大分子的范畴，不能够有分别效果 同样两种小分子全部都能进入凝胶颗粒内部空隙， Kd=1，虽然它们在分子量大小仍有差别，但由于它们曾经超出了该凝胶质的所能分别小分子的范畴，同样也不能够有分别效果因此，不同型号的凝胶介质有不同的相对分子质量分别范畴在进展排阻层析之前，根据分别的相对分子质量选择适宜的凝胶介质3.0

4.Kd>1时，表示凝胶具有一定的吸附作用，此时Ve>Vo+Vi例如某些芳香族化合物的洗脱体积远超出实际计算的最大值，这些化合物的Kd值普通都是大于1的如苯丙氨酸、酪氨酸及色氨酸在SephadexG-25中的Kd值分别为1.2、1.4和2.2 在实践任务中，小分子不易得到Kd=1的数值，尤其是对交联度大的凝胶介质Kd差别较明显，好像样一个小分子在SphadexG-10柱层析测得的Kd是0.75左右，同样一个小分子在SphadexG-25柱层析测得的Kd是0.8左右 呵斥这种差别的缘由是由于一部分水分子与凝胶结合较结实，成为凝胶本身的一部分，使凝胶的有效网状孔变小，小分子不能分散和浸透到凝胶内部，是凝胶失去了部分筛分作用所致此时的Vi不能以凝胶的吸水量进展计算，因此，通常以小分子化合物经过凝胶柱来测定Vi值另外一种计算方法是不运用Vi和Kd，而是用Kav，(有效分配系数)替代Kd，定义如下  在这里实践上是将原来以水作为固定相(Vi)改为凝胶颗粒(Vt-Vo)作为固定相，而洗脱剂(Ve-Vo)作为流动相Kav，和Kd值对交联度较小的凝胶介质差别不大，而对交联度大的凝胶介质差别较大。

在排阻层析过程中，凝胶层析介质普通情况对流动相的组分无吸附作用，当流动相的体积Vt流过后，上样后的一切组分都该当被洗脱出来，这是凝胶排阻层析与其他的层析方法所不同之处五、五、Ve与相对分子质量的关系与相对分子质量的关系 对同一类型的化合物，洗脱特性与组分的相对分子质量有关，各种组分流过凝胶柱时，洗脱顺序按相对分子质量(Mr)的大小陈列先后流出Ve与Mr的关系式如下 Ve=K1-K2lgMr (1-7)式中： K1-常数； K2-常数； Mr-相对分子质量； Ve-洗脱体积A-Sephadex G100;B-sephadex G-200 有时Ve也可以用分别体积(Ve-Vo)、相对保管体积(Ve/Vo)、简化洗脱体积(Ve／Vt)或有效分配系数(Kav)替代，它们与相对分子质量的关系与公式(1-7)一样，只是常数不同但实践操作过程中大多数都是以Kav对相对分子质量的对数(1gMr)作图，得到任务曲线，也称之为“选择曲线〞，如图3所示 曲线的斜率是阐明凝胶的性质，是一个重要的特征在凝胶允许的分别范围内，曲线的斜率越陡，分级分别的效果越好。

 凝胶排阻层析分别主要决议于溶质中相对分子质量的大小和相应凝胶的交联度在同一类型的生物大分子(球形分子或线形分子)的前提下，凝胶分级分别的范围越窄，测定的相对分子质量越准确凝胶排阻层析具有设备简单、操作方便、反复性好、条件温暖等优点，是实验室测定相对分子质量常用的方法，也是生物大分子分别纯化常用的分别手段第三节凝胶层析介质第三节凝胶层析介质 一、凝胶的根本性质一、凝胶的根本性质 自然界天然凝胶和化学合成的凝胶种类自然界天然凝胶和化学合成的凝胶种类很多，但能用排阻层析的凝胶那么不多排很多，但能用排阻层析的凝胶那么不多排阻层析的凝胶是一种球形颗粒，球内部是多阻层析的凝胶是一种球形颗粒，球内部是多孔网状构造与普通凝胶在性能上主要有以孔网状构造与普通凝胶在性能上主要有以下几点区别下几点区别1.化学稳定性 合成凝胶的原料和合成凝胶介质以后所保管的化学基团(如羟基等)必需具有良好的惰性，不与待分别物质发生化学反响，不影响被分别物质原有的性质(如生物活性、构象等)；在比较苛刻的环境中(在偏碱或偏酸的溶液中和在高浓度的盐溶液中)不发生降解、变性反响，坚持相对稳定2.无特异性吸附 凝胶颗粒上不存在或存在极少的离子基团，不与溶液中的离子化合物发生离子交换、吸附或亲和反响。

在低离子强度下，洗脱峰不出现拖尾景象，被分别物质有较高的回收率3.具有较好的耐受性 凝胶颗粒对温度和有机溶剂具有较好的耐受性，尤其是对物理聚合的凝胶，在高温下(100℃左右)不发生熔融，在有机溶剂中凝胶的体积不发生收缩变形4.刚性好 凝胶颗粒具有一定机械强度，在允许的操作压范围内，柱床体积坚持稳定，在层析的过程中流速不发生改动二、凝胶层析介质的分类二、凝胶层析介质的分类 目前，常用于排阻层析的凝胶类介质主要有4大类，即葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶和琼脂糖-聚丙烯酰胺混合凝胶等层析介质1.葡聚糖凝胶层析介质 葡聚糖凝胶层析介质是由多聚葡聚糖经过与环氧氯丙烷交联而合成的，是一类具有网状构造的珠状凝胶颗粒葡聚糖凝胶交联的程度(简称交联度)与凝胶颗粒网状构造孔径的大小有直接关系，交联度越大，网状构造的孔径越小，分别的分子量就小；反之，交联度越小，网状构造的孔径越大，分别的分子量就大葡聚糖凝胶交联构造如图4 交联的葡聚糖不溶于有机溶剂和水的聚合物，但由于其构造中含有大量的羟基，又具有很强的亲水性，能迅速在水和电解质溶液中溶胀，在层析过程中非常容易与水溶性溶质接触。

合成的葡聚糖凝胶在酸性条件下糖苷键容易被水解，在碱性环境中比较稳定普通在0.25mol／L NaOH溶液中，60℃的条件下放置两个月以上仍不改动其原有的根本性质所以常用稀碱溶液处置葡聚糖凝胶层析介质，以除去残留在凝胶介质上的变性蛋白和其他杂质l 在氧化剂的作用下葡聚糖凝胶上的羟基容易氧化成羧基，添加了带电荷基团，容易与溶液中的离子化合物发生交换反响，使其非特异性吸附的才干加强，从而影响分别效果和回收率葡聚糖凝胶对温度具有较好的耐受性，通常在溶胀形状的葡聚糖凝胶可以耐受110℃高温，而在未溶胀形状下的干胶可以耐受120℃ 的高温 最常用的葡聚糖凝胶层析介质是SephadexG 系列产品，它是由Pharmacia消费的，介质的型号不同，其交联度也不同，分别相对分子质量的范围有差别例如SephadexG-25、SephadexG-50、SephadexG-75、SephadexG-100、SephadexG-200等，代表着不同型号的葡聚糖凝胶，英文字母G后面的阿拉伯数字，表示凝胶吸水量不同型号的葡聚糖凝胶的有关技术参数见表-1表表-1 葡聚糖凝胶层析介质的有关技术参数葡聚糖凝胶层析介质的有关技术参数凝胶型号凝胶型号 颗粒大小颗粒大小／／µmµm 溶胀体积溶胀体积／／(m1(m1／／g)g) 分离范围分离范围(M(Mr r) ) Sephadex G-10 Sephadex G-10 Sephadex G-15 Sephadex G-15 Sephadex G-25 Sephadex G-25 Sephadex G-50 Sephadex G-50 Sephadex G-75 Sephadex G-75 Sephadex G-100 Sephadex G-100 Sephadex G-150 Sephadex G-150 Sephadex G-200 Sephadex G-200 40 40～～120120 40 40～～120120 50 50～～150150 50 50～～150150 40 40～～120120 40 40～～120120 40 40～～120120 40 40～～120120 2 2～～3 3 2 2．．5 5～～3 3．．5 5 4 4～～6 6 9 9～～1111 12 12～～1515 15 15～～2020 20 20～～3030 20 20～～4040 小于小于7 7××10102 2 小于小于1 1．．5 5××10103 3 1 1．．0 0××10103 3 ～～ 5 5．．0 0××10103 3 1 1．．5 5××10103 3 ～～ 3 3．．0 0××10104 4 3 3．．0 0××10103 3 ～～ 8 8．．0 0××10104 4 4 4．．0 0××10103 3 ～～ 1 1．．0 0××10105 5 5 5．．0 0××10103 3 ～～ 3 3．．0 0××10105 5 5 5．．0 0××10103 3 ～～ 6 6．．0 0××10105 5  SephadexG系列产品，“G〞后面的阿拉伯数字越大，表示交联度越小，凝胶孔径越大，相对分子质量分别范围越大，凝胶的溶胀体积大。

与此相反，“G〞后面的阿拉伯数越小，表示交联度越大，凝胶孔径越小，相对分子质量分别范围越小，凝胶的溶胀体积小 凝胶的特性：具有耐高温(100℃沸水煮)、在酸性或碱性条件下稳定〔在pH2～11范围内稳定)，但是在高盐浓度下体积易收缩，凝胶的刚性较差 2.琼脂糖凝胶层析介质 琼脂是自然界广泛存在的一种天然多糖混合物，主要来源于海藻琼脂主要由两部分组成，一部分是中性链状多糖，称为琼脂糖(agarose)，其根本构造是由B-D-吡喃半乳糖和3，6-脱水-L-吡喃半乳糖相间结合而成的链状多糖；另一部分是带负电荷的琼脂糖(agaropectin)，在分子中含有磺酸基和羧基，在制备琼脂糖时需求用氯代十六烷吡啶或聚乙烯醇等有机溶剂将琼胶沉淀除去其部分构造如下 图图5 目前能消费琼脂糖凝胶层析介质厂家很多，消费工艺和产品的称号也因消费厂家不同而异，但介质的根本性能都很相近例如瑞典消费的Sepharose系列、美国消费的SuperAgoGel系列、英国消费的Sagavac系列、丹麦消费的Gelarose系列、我国消费的QT系列等都是以琼脂糖为原料制成的  琼脂糖凝胶是一种大孔胶，由于半乳糖的分子中含有许多羟基，具有良好的亲水性，在层析过程中非常容易与水溶性溶质或溶剂接触。

它的交联度随着琼脂的浓度添加而增大，制备时以物理的方式聚胶，首先配制一定浓度的琼脂糖，加温直至使其完全融化，然后迅速冷却获得凝胶，凝胶内部的网状构造主要是依托糖链之间的次级键如氢键来维持稳定，网状孔径的大小经过改动凝胶的交联度来控制琼脂糖分子中不带电荷，所以非特异性吸附较少，样品在排阻层析分别时回收率较高  由于琼脂糖凝胶链与链之间不是共价结合，所以对于未经特殊处置的琼脂糖凝胶，当环境的温度高于56oC时就会开场融化，假设经过特殊方式处置或经过交联的琼脂糖可以耐受100～120℃的高温，机械强度也有较大的提高  最 常 用 的 琼 脂 糖 凝 胶 层 析 介 质 是SepharoseB系列产品，它是由Pharmacia消费的，介质的型号不同，其交联度也不同，分别分子量的范围有差别例如，Sepharose 4B、Sepharose 6B、Sepharose 8B等不同型号的琼脂糖凝胶表示不同的琼脂糖百分含量，有关技术参数见表2凝胶型号凝胶型号 颗粒大小颗粒大小／／µmµm 凝胶浓度凝胶浓度／％／％ 分离范围分离范围(Mr)(Mr) Sepharose 2BSepharose 2BSepharose 4BSepharose 4BSepharose 6BSepharose 6B Sepharmse 8BSepharmse 8BSepharose12BSepharose12B 50 50～～130130 50 50～～130130 50 50～～130130 50 50～～130130 50 50～～130130 2 2 4 4 6 6 8 8 12 12 5 5××10105 5～～1515××10107 7 2 2××10105 5～～1515××10106 6 5 5××10104 4～～2 2××10106 6 2 2××10104 4～～7 7××10105 5 5 5××10103 3～～5 5××10104 4 表表2 琼脂糖凝胶层析介质的有关技术参数琼脂糖凝胶层析介质的有关技术参数 在SepharoseB系列产品中，“B〞前面的阿拉伯数字表示琼脂糖的百分浓度，琼脂糖浓度越高表示交联度越大，凝胶孔径越小，相对分子质量分别范围越小。

与此相反琼脂糖浓度越低表示交联度越小，凝胶孔径越大，相对分子质量分别范围越大，因此琼脂糖凝胶的交联度表示方法与葡聚糖凝胶相反  琼脂糖凝胶的特性：具有良好的大孔性和机械强度，交联的琼脂糖凝胶除了能耐受120 ℃ 蒸汽压力处置外，还可以耐受一定的酸碱度(在pH3～12范围内稳定)和在6M尿素中不变形3. 聚丙烯酰胺凝胶层析介质 聚丙烯酰胺凝胶是一种化学合成的凝胶，组成的根本单位是丙烯酰胺(acrylamide，简称Acy)，也称之为单体，分子式(CH2＝CII-CONH2)；交联剂是N，N-亚甲基双丙烯酰胺(N，N，-methylenebisacrylamide，简称bis)丙烯酰胺和N，N二亚甲基双丙烯酰胺在自在氧基的诱发下发生聚合反响，在制备过程中经过特殊工艺合成球形的聚丙酰胺凝胶珠经过控制丙烯酰胺浓度和N，N，-亚甲基双丙烯酰胺的比例，就可以得到不同交联度的聚丙酰胺凝胶其部分构造式如下 聚丙烯酰胺凝胶层析介质的稳定性不如交联的聚葡糖凝胶，它在酸性的条件下酰胺键容易被水解生成羧酸，使凝胶介质带有一定的离子交换基团，在排阻层析时对溶液中带电荷组分发生离子交换作用，使介质的非特异性吸附添加。

因此，聚丙烯酰胺凝胶层析该当尽量防止运用酸性较强的缓冲液虽然目前运用的聚丙烯酰胺凝胶层析介质在阐明书上阐明对酸碱溶液有较大的耐受性(在pH2～11的溶液中)，但是，假设介质长时间处于酸性环境中还是有一定影响的  最常用的聚丙烯酰胺凝胶层析介质是Bio-Gel-P系列产品，它是由Bio-Rad公司消费的，介质的型号不同，其交联度也不同，分别相对分子质量的范围有差别介质的有关技术参数见表3表表3聚丙烯酰胺凝胶层析介质的有关技术参数聚丙烯酰胺凝胶层析介质的有关技术参数 凝胶型号凝胶型号 溶胀体积溶胀体积／／(ml(ml／／g)g) 排阻下限排阻下限(×10(×103 3) ) 分离范围分离范围(Mr)(Mr) Bio-Gel P Bio-Gel P～～2 2 Bio-Gel P Bio-Gel P～～4 4 Bio-Gel P Bio-Gel P～～6 6 Bio-Gel P Bio-Gel P～～1010 Bio-Gel P Bio-Gel P～～3030 Bio-Gel P Bio-Gel P～～6060 Bio-Gel P Bio-Gel P～～100100 Bio-Gel P Bio-Gel P～～150150 Bio-Gel P Bio-Gel P～～200200 Bio-Gel P Bio-Gel P～～300300 3.83.8 5.8 5.8 8.8 8.8 12.4 12.4 14.9 14.9 19.0 19.0 19.0 19.0 24.0 24.0 34.0 34.0 40.0 40.0 1.61.6 3.6 3.6 4.6 4.6101030306060100100150150200200300300 2 2××10102 2～～2 2××10103 3 5 5××10102 2～～4 4××10103 3 1 1××10103 3～～5 5××10103 3 5 5××10103 3～～1.71.7××10104 4 2 2××10104 4～～5 5××10104 4 3 3××10104 4～～7 7××10104 4 4 4××10104 4～～1 1××10105 5 5 5××10104 4～～1.51.5××10105 5 8 8××10104 4～～3 3××10105 5 1 1××10105 5～～4 4××10105 5  在Bio-GelP系列产品中，“P〞后面的阿拉伯数字越大，表示交联越小，凝胶孔径越大，相对分子质量分别范围越大，凝胶的溶胀体积越大。

与此相反，“P〞后面的阿拉伯数字越小，表示交联越大，凝胶孔径越小，相对分子质量分别范围越小，凝胶的溶胀体积越小它与葡聚糖凝胶介质的表示方法一样  聚丙烯酰胺凝胶的特点：具有良好的大孔性和机械强度，交联后具有一定的耐受性但在低于pH2的酸性环境中或高温下，分子中的酰胺基易被水解产生羧酸；对偏酸或偏碱性的化合物及芳香族类化合物均有不同程度的吸附4.琼脂糖-聚丙烯酰胺混合凝胶层析介质 琼脂糖-聚丙烯酰胺混合凝胶层析介质是由琼脂糖聚丙烯酰胺按不同比例制成的混合型凝胶它利用聚丙烯酰胺作为三维空间骨架，在骨架中间填充琼脂糖凝胶，由于聚丙烯酰胺骨架机械性能比琼脂糖凝胶高，制成的凝胶刚性好，孔径大，很适宜于生物大分子的分别制备这类介质在工艺和技术上要比制备单一资料的凝胶复杂得多其理化性质介于琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶之间 最常用的琼脂糖聚丙烯酰胺混合凝胶层析介质是UltrolGelAcA系列介质的主要技术参数见表4 表表4 琼脂糖．聚丙烯酰胺混合凝胶层析介质琼脂糖．聚丙烯酰胺混合凝胶层析介质的主要技术参数的主要技术参数凝胶型号凝胶型号 丙烯酰胺丙烯酰胺  浓度／％浓度／％琼脂糖琼脂糖  浓度／％浓度／％ 分离范围分离范围(M(Mr r) )Ultrol Gel AcA22Ultrol Gel AcA22Ultrol Gel AcA34Ultrol Gel AcA34 Ultrol Gel AcA44Ultrol Gel AcA44Ultrol Gel AcA54Ultrol Gel AcA54 2 2 3 3 4 4 5 5 2 2 4 4 4 4 4 4 1 1××10105 5～～1.21.2××10106 62 2××10104 4～～3.53.5××10105 5 1 1××10104 4～～1.31.3××10105 5 5 5××10103 3～～7 7××10104 4  UltrolGel“AcA〞表示合成时用的丙烯酰胺和琼脂糖的量，其后面阿拉伯数字分别表示聚丙烯酰胺和琼脂糖的百分浓度，阿拉伯数字越小表示丙烯酰胺和琼脂糖浓度越低，其交联度越小，凝胶孔径越大，分别分子量的范围越大。

与此相反，阿拉伯数字越大表示丙烯酰胺和琼脂糖浓度越高，其交联度越大，凝胶孔径越小，分别分子量的范围越小交联度的表示方法与琼脂糖凝胶一样 三、凝胶的规格与用途三、凝胶的规格与用途 凝胶排阻层析介质根据其用途和运用的规模，具有不同的规格，也就是说在同一交联度、同一性能的条件下的凝胶介质有不同的规格主要从球形介质的直径大小可以分为粗、中粗、中细、细、超细等几类，但不同型号的凝胶分类略有区别，如中粗葡聚糖凝胶颗粒，直径大小普通在40～120µm之间，而琼脂糖凝胶颗粒，直径大小：—般在50～150／µm之间不同规格的凝胶见表5所示 表表5 5 不同规格的凝胶及用途不同规格的凝胶及用途 凝胶规格凝胶规格 粒度范围粒度范围/µ/µm 用用 途途 粗粗 中粗中粗 中细中细 细细 超超细细 100 100～～300300 40 40～～160160 20 20～～8080 10 10～～4040 3 3～～5 5 大规模制备或工业化生产析大规模制备或工业化生产析常规分析或小量制备常规分析或小量制备实验室分析测定或微量制备实验室分析测定或微量制备 微量分析微量分析超微量分析或用于超微量分析或用于HPLCHPLC填料填料 四、凝胶性能的比较四、凝胶性能的比较 不同的凝胶层析介质，由于合成介质的原料不同,其分辨率存在着较大的差别。

例如SephadexG-75和Bio-GelP-30分别同一种样品，SephadexG-75分别的不如Bio-GelP-30好，如图7-1所示同一种凝胶介质不同型号，由于它们的交联度不同，其分辨率也会有较大的差别例如SephadexG-75、SephadexG-100、SephadexG-150的分辨率有较大的差别如图7-2所示第四节第四节 凝胶〔排阻〕层析分别条件确实定凝胶〔排阻〕层析分别条件确实定一、凝胶一、凝胶层析介析介质的的选择1.1.凝胶凝胶层析介析介质型号的型号的选择 根据相根据相对分子分子质量分量分别范范围选择相相应型型号的凝胶介号的凝胶介质，确定是，确定是组别分分别还是是组分分分分别组别分分别是指相是指相对分子分子质量之量之间相差很相差很大大( (数十至数百倍数十至数百倍) )的的样品，如生物大分子与有品，如生物大分子与有机小分子或无机机小分子或无机盐等的分等的分别；；组分分分分别是指是指相相对分子分子质量之量之间相差相差较小小(±2000(±2000以上以上) )的生的生物大分子物大分子 组别分别普通选用交联度较大的凝胶层析介质，例如，蛋白质脱盐可选用葡聚糖凝胶SephadexG-25或聚丙烯酰胺凝胶Bio-GelP-6、Bio-GelP-10。

组分分别要根据被分别组分所预测的最大相对分子质量的上限值和最小相对分子质量的下限值的分别范围来选择适宜的凝胶如分别相对分子质量在5000～60000之间的多种组分，可选用葡聚糖凝胶SephadexG-75或UltrolGelAcA542.凝胶粒度的选择 选择凝胶粒度的大小，主要是基于分别样品是层析的规模或相邻两组分相对分子质量的差别进展选择粒度较大的凝胶介质流速快，适于具有一定规模的分别或者组别分别，但由于其颗粒大层析时涡旋分散影响较大，被分别组分在柱内容易分散，分辨率较低粒度较小的凝胶介质适于分析分别，层析时涡旋分散影响较小，组分在柱内分散小，分辨率相对较高，但流速较慢实验室常用的凝胶介质的粒度范围是中粗级  凝胶介质粒度的均匀性也是很重要的，凝胶介质的最大颗粒和最小颗粒的差值越小越好，阐明介质的均匀度好均匀度好的介质流速相对于均匀度差的介质快，效率高二、层析柱的选择二、层析柱的选择 层析柱的选择，主要思索被分别组分相对分子质量的差别，选用相应的柱长与柱内径之比的层析柱对于组别分别的层析柱，由于被分别的组分相对分子质量差别较大可采用短粗的层析柱，柱长度：柱内径=10：1或20：1，如脱盐柱。

对组分分级分别的层析柱，用细长的层析柱；柱长度：柱内径=50：1或100：1，如蛋白质组分分别三、流动相的选择三、流动相的选择 排阻层析所运用的缓冲溶液比较简单，普通只运用一种缓冲液但是在选择缓冲溶液时主要思索3方面的要素：1.思索被分别物质的稳定性，包括缓冲液的pH值、离子强度及维护剂等2.思索凝胶介质的稳定性能，不与介质发生化学反响，不变形，不降解3.思索分别物质的后处置，被分别组分经排阻层析分别后还需采用其他层析方法进展分别(如用离子交换或亲和层析分别等)，最好选用与后续层析方法一样的缓冲液假设后处置是冰冻枯燥，可选用易挥发性的溶液如NH4HC03、HAC或NH40H等四、样液的制备四、样液的制备 排阻层析的样液在上样前，要进展适当的处置，去部分杂质样液的浓度不宜太稀，组分不宜太多，质量至少要相差±2000以上 五、上样体积五、上样体积 排阻层析的上样量相对于其他层析方法要求更严厉，上样后的各个组分随着流动相往前流动，不会停留在介质上各个组分的分别峰极容易产生分散效应，流出体积只需增大，而不会减少普通情况，对组分分别的洗脱体积是原体积的几倍至几十倍。

因此对组分分别的上样体积不超越柱床体积的0.5％～5％；组别分别的上样体积不超越柱床体积的30％第五节第五节 凝胶介质的后处置凝胶介质的后处置 一、凝胶柱的保管一、凝胶柱的保管 凝胶柱内的层析介质是浸泡在溶液中，容凝胶柱内的层析介质是浸泡在溶液中，容易长菌尤其是葡聚糖和琼脂糖类凝胶介质，易长菌尤其是葡聚糖和琼脂糖类凝胶介质，极易染菌，某些微生物能分泌降解多糖糖苷极易染菌，某些微生物能分泌降解多糖糖苷键的酶，使葡聚糖和琼脂糖的糖苷键发生降键的酶，使葡聚糖和琼脂糖的糖苷键发生降解，而改动凝胶层析介质原有的性质解，而改动凝胶层析介质原有的性质 虽然聚丙烯酰胺凝胶介质不容易被微生物所降解，但长期浸泡在溶液中容易孳生细菌，使其化学性质发生某些变化，如发生氧化，离子化等而改动层析的特性：为了防止微生物的生长，残留在凝胶柱内的磷酸盐和有机物必需求洗净，然后将层析柱真空或低温保管低温保管的温度不能低于柱内溶液的冰点，防止柱内的凝胶结冰，而破坏凝胶的交联度和网状构造 防止微生物生长最常用的方法是在凝胶溶液中加人一定的抑菌剂，如0.02％叠氮钠、0.01％～0.02％三氯丁醇、0.005％～0.01％乙基汞硫代水杨酸钠、0.001％～0.01％苯基汞代乙酸盐、苯基汞代硝酸盐或苯基汞代硼酸盐等。

二、二、 凝胶介质的处置与枯燥凝胶介质的处置与枯燥 凝胶层析介质普通不与溶液中的溶质发生任何作用，所以在层析分别后用平衡液稍加平衡即可进展下一次层析，但是在实践操作中经常有些杂质污染凝胶和层析柱外表的凝胶因此，层析柱在运用一段时间后必需做适当的处置，除去凝胶外表的污染物处置所用的溶液和溶液浓度略有不同，普通对交联的葡聚糖凝胶类介质可以用0.1 mol／L NaOH和0.5 mol／L NaCl混合处置，聚丙烯酰胺和琼脂糖凝胶类介质可以用0.5～1.0mol／L NaCl溶液处置  凝胶层析介质假设在较长的时间内不再运用，可以将其枯燥长期保管运用过的凝胶层析介质，首先按普通的再生程序将介质再生处置、漂洗干净，然后用乙醇从低浓度到高浓度逐级脱水(先后用30％、50％、70％、80％、95％、无水乙醇、乙醚)，脱水后的介质在室温下晾干，将乙醚挥发尽，即可第六节凝胶过滤〔排阻〕的分别方式第六节凝胶过滤〔排阻〕的分别方式一、脱盐一、脱盐 在生物大分子的分别纯化过在生物大分子的分别纯化过程时，常用一些无机盐或有机小程时，常用一些无机盐或有机小分子作为洗脱剂，在洗脱液中经分子作为洗脱剂，在洗脱液中经常含有较高浓度的盐或其他小分常含有较高浓度的盐或其他小分子化合物，普通要将小分子和生子化合物，普通要将小分子和生物大分子分开，常采用透析的方物大分子分开，常采用透析的方法。

虽然透析法操作简单，但是法虽然透析法操作简单，但是费时，处置的量有限；假设采用费时，处置的量有限；假设采用排阻层析法除盐，既可以节省时排阻层析法除盐，既可以节省时间，又不影响生物大分子的特性间，又不影响生物大分子的特性 脱盐最常用的凝胶介质是Sephadex G-25例如经三氯乙酸提取的卵黏蛋白，经Sephadex G-25柱层析除去鸡卵黏蛋白中的盐，见图8所示 蛋白质脱盐时，某些蛋白质由于脱盐后溶液中电解质下降，导致其溶解度降低，有时会出现沉淀或被吸附在柱上洗不下来遇见这种情况，可以用挥发性的盐类洗脱，然后冰冻枯燥二、测定相对分子质量二、测定相对分子质量 凝胶排阻层析是测定相对分子质量的一个常用的方法运用一系列知相对分子质量的混合规范品在同一凝胶柱内同一条件下进展分别，搜集每一个组分的洗脱体积，然后将每一个组分的洗脱体积对相对分子质量的对数作图，获得规范相对分子质量的任务曲线，也称之为规范曲线 在同样的条件下将未知样品经过凝胶排阻层析分别，并获得未知样品的洗脱体积，用该洗脱体积从规范曲线上查得未知样品相对分子质量的对数值，在查反对数就知道该样品的相对分子质量。

如图9所示，以牛血清蛋白(67000)、鸡卵清清蛋白(43000)、糜蛋白酶原(25000)、(20000)、细胞色素(12000)为例 凝胶排阻层析是测定相对分子质量的方法不需求复杂的仪器设备，操作简单，样品用量少，具有一定的运用价值但是此法测定的相对分子质量会产生一定偏向，线形分子和球形分子也有所不同，在同样的条件下线形分子的结果会偏大，球形分子会偏小凝胶排阻层析测定的相对分子质量与生物大分子的外形有亲密的关系，如某些线形蛋白、球形蛋白、纤维蛋白和糖蛋白等 因此，在测定时假设未知样品是球形分子最好选择球形分子作规范蛋白，未知样品是线形分子最好选择线形分子作规范蛋白质，这样产生的偏向相对小一些假设对未知样品相对分子质量的准确测定还需求与其他相对分子质量的测定方法进展比较，参考其他方法做出判别三、分别蛋白质三、分别蛋白质 凝胶排阻层析是生物大分子在分别纯化过程中不可短少的一种手段，它是经过分子的质量进展分别独一的一种技术在层析方法中绝大多数都是以化合物的电荷差别进展分别的(如离子交换层析、螯合层析、吸附层析等)或以化合物的极性进展分别(如分配层析、反相层析、疏水层析等)。

 凝胶排阻层析可以将相对分子质量相近、分子构造和外形类似的化合与其他分子分开例如SephadexG-75柱层析可以分别相对分子质量在3000～80000球形蛋白分子或1000～50000线形蛋白分子用SephadexG-50柱层析从大鼠睾丸的提取液中分别金属结合蛋白，如图10所示第七节第七节 运用实例运用实例 鸡卵黏蛋白相对分子质量的测定鸡卵黏蛋白相对分子质量的测定一、原理一、原理 葡聚糖凝胶葡聚糖凝胶SephadexG-75SephadexG-75的相对的相对分子质量分别范围在分子质量分别范围在30003000～～8000080000之间用用4 4种知相对分子质量蛋白经过种知相对分子质量蛋白经过SephadexG-75SephadexG-75排阻层析分别，得到相排阻层析分别，得到相应的洗脱峰，分别合并各洗脱峰的体应的洗脱峰，分别合并各洗脱峰的体积，并可计算出各种规范蛋白质的积，并可计算出各种规范蛋白质的Kav,Kav,以相对分子质量的对数以相对分子质量的对数lgMrlgMr为横为横坐标，坐标，KavKav为纵坐标，绘出规范曲线为纵坐标，绘出规范曲线然后将卵黏蛋白在然后将卵黏蛋白在SephadexG-75SephadexG-75排阻排阻层析分别得到相应的洗脱峰所计算出层析分别得到相应的洗脱峰所计算出来的来的KavKav值，从规范曲线上查得相应的值，从规范曲线上查得相应的lgMrlgMr，即可知道卵黏蛋白的相对分子，即可知道卵黏蛋白的相对分子质量。

质量二、试剂与资料试剂:规范相对分子质量蛋白质，卵黏蛋白， 蓝色葡聚糖-2000，乙酸，乙酸钾等资料:SephadexG-75，层析柱(1cm×l00cm) 三、操作步骤三、操作步骤1.凝胶介质的选择及溶胀 称取10g SephadexG-75干粉放人500ml的烧杯中，参与200m1 0.025mol／L 氯化钾, 0.2mol／L乙酸缓冲液，在沸水浴中热溶胀2h，冷却至室温后，抽真空脱去凝胶中残留的空气，或在室温下溶胀24h，真空脱气，备用2. 装柱 取一支长度为100cm，内径为lcm的层析柱洗净，向柱内装人1/4左右柱床体积的缓冲液，然后把溶胀处置好的SephadexG-75，一次装入层析柱内，在柱的下端用夹子夹住，上端插一个漏斗，漏斗柄与柱上端密封连为一体，再将剩余的凝胶装入漏斗中，使凝胶渐渐沉降，等凝胶完全沉淀好以后，取出柱上端的漏斗，拧紧柱头塑料帽，将接口的乳胶管与盛有缓冲液的储液瓶衔接，调理好流速(流速为3ml/min)平衡3. 样品溶液的预备〔1〕规范蛋白质混合液的配制 称取牛血清清蛋白、鸡卵清清蛋白、以胰凝乳蛋白酶原A和牛胰岛素各2～3mg，溶解在lml的缓冲液中。

〔2〕未知蛋白质样品溶液的配制 称取3mg左右的未知蛋白质，参与lml的缓冲液溶解〔3〕蓝色葡聚糖-2000溶液的配制 称取3mg左右的蓝色葡聚糖-2000，参与lml的缓冲液溶解，然后参与5ul的丙酮4.上样 拧开柱上端的螺旋帽，待柱内的缓冲液下降至与凝胶外表相切取lml样品溶液沿着管壁小心加在胶上面，开场搜集体积等样品溶液完全进入凝胶后，用2ml缓冲液沿管壁洗一次，等溶液完全进入凝胶再参与几毫升缓冲液，然后拧紧柱上端的螺旋帽接口与储液瓶衔接，柱的出口端与紫外检测仪和部分搜集器相连 采用凝胶排阻层析测定蛋白质相对分子质量时，规范蛋白、未知蛋白、蓝色葡聚糖-2000 3种溶液最好分别上样为了使每次上样的组分不相互关扰，在每进展一次分别后都要等流出体积到达柱床体积1.5倍以上，才干第2次上样5.洗脱 在恒定的操作压和流速的条件下进展洗脱，留意察看洗脱峰出现的位置假设用部分搜集器搜集，留意标明顶峰管的位置，等层析终了后，合并顶峰管以内的各管搜集液，量取总体积即可得到每个组分的洗脱体积Ve 四、分子量的方法四、分子量的方法1.Vo和Vi的测定 取0.5ml浓度为2mg／ml的蓝色葡聚糖-2000内含5ul的丙酮混合液参与到SephadexG-75柱上面，洗脱、紫外监测仪监测流出峰。

分别搜集蓝色葡聚糖2000和丙酮的洗脱峰，测出它们的洗脱体积Ve由于蓝色葡聚糖-2000在柱内为全排阻，的洗脱积Ve就是外水体积Vo，丙酮为全浸透的小分子，它的洗脱积Ve就是内水体积Vi2.规范蛋白质Ve的测定 取0.5ml规范蛋白质混合液参与到SephadexG-75柱上，洗脱、紫外监测仪监测流出峰分别搜集各规范蛋白质的洗脱峰，丈量它们的洗脱体Ve以公式(1-5)计算出各规范蛋白质的Kav以规范蛋白质的相对分子质量的对数lgMr)为横坐标，Kav为纵坐标，绘出规范曲线3.未知样品Ve的测定 取0.5ml浓度为3mg/ml未知样品溶液，参与到SephadexG-75柱上面，洗脱、紫外监测仪监测流出峰搜集洗脱峰，测出它的洗脱体积Ve以公式；(1-5)计算出Kav然后从规范曲线上查得相应的相对分子质量对数，再查反对数便可知道未知样品的相对分子质量4.柱床体积Vt的测定 柱床体积Vt的测定有两种方法，一种方法是在层析终了以后，在层析柱凝胶与缓冲液的界面处做一个标志，然后把凝胶全部转移出来，并往柱内注入水至标志处，再将水放出置于一个100ml的量筒内，量取水的体积，就可获得柱床体积Vt。

另一种方法是分别量出凝胶柱床体积的高度和层析柱的内径，经过圆柱体的公式求出柱床体积Vt五、测定相对分子质量应留意的问题五、测定相对分子质量应留意的问题1.缓冲液pH最好控制在酸性条件下 (pH4-5乙酸-乙酸钾)，以防止胰岛素解聚，构成单体，其相对分子质量发生变化2.装好的柱或在层析过程中柱内不能产生气泡，柱内的气泡为死体积，它不断影响分别效果，而且还会影响洗脱体积，给测定的相对分子质量带来误差3.操作压和流速要稳定，假设操作压不稳定会呵斥柱床体积发生变化，所丈量的Ve就会不准确，也会影响测定相对分子质量的准确性4.层析主要选择细长，普通选择的是100cm ×lcm层析柱，而柱床体积的高度普通要到达90～95cm假设选择了长的柱，而柱床体积没有到达应有的高度，就会影响各组分的分别效果5.溶胀的凝胶层析介质一定要放在冰点以上低温下保管，暂时不用的凝胶柱需求参与适当的防腐剂，如叠氮化钠、氯仿、甲苯等，以防止微生物生长。