微生物学教学课件--第10章-微生物与基因工程.ppt

第10章 微生物与基因工程是指对遗传信息的分子操作和施工，即把分离到的或对遗传信息的分子操作和施工，即把分离到的或合成的基因经过改造，插入载体中，导入宿主细胞内，合成的基因经过改造，插入载体中，导入宿主细胞内，使其扩增和表达，从而获得大量基因产物，或者令生使其扩增和表达，从而获得大量基因产物，或者令生物表现出新的性状物表现出新的性状基因工程（genetic engineering）或重组DNA技术(recombinant DNA technology)第一节第一节 微生物基因工程的发展微生物基因工程的发展一、基因工程的发展历史一、基因工程的发展历史对基因工程的建立与发展具有重要意义的几项关键技术：对基因工程的建立与发展具有重要意义的几项关键技术：DNA的特异切割的特异切割DNA的分子克隆（人工转化方法的建立）的分子克隆（人工转化方法的建立）DNA的快速测序的快速测序二、微生物学与基因工程的关系二、微生物学与基因工程的关系1 1）基因工程所用克隆载体主要是用病毒、噬菌体和质粒改造而成；基因工程所用克隆载体主要是用病毒、噬菌体和质粒改造而成；2 2）基因工程所用千余种工具酶绝大多数是从微生物中分离纯化得到的基因工程所用千余种工具酶绝大多数是从微生物中分离纯化得到的；3 3）微生物细胞是基因克隆的宿主，即使植物基因工程和动物微生物细胞是基因克隆的宿主，即使植物基因工程和动物基因工程也要先构建穿梭载体，使外源基因或重组体基因工程也要先构建穿梭载体，使外源基因或重组体DNA在大肠杆菌中得到克隆并进行在大肠杆菌中得到克隆并进行拼接和改造，才能再转移到植物和动物细胞中拼接和改造，才能再转移到植物和动物细胞中；4 4）为大规模表达各种基因产物，从事商品化生产，通常都是将外源基因表达载体导入为大规模表达各种基因产物，从事商品化生产，通常都是将外源基因表达载体导入大肠杆菌或是酵母菌中以构建成工程菌，利用工厂发酵来实现的；大肠杆菌或是酵母菌中以构建成工程菌，利用工厂发酵来实现的；5）微生物的多样性，尤其是抗高温、高盐、高碱、低温等基因，为基因工程提供了极微生物的多样性，尤其是抗高温、高盐、高碱、低温等基因，为基因工程提供了极其丰富而独特的基因资源其丰富而独特的基因资源6 6）有关基因结构、性质和表达调控的理论主要也是来自对微生物的研究中取得的，或有关基因结构、性质和表达调控的理论主要也是来自对微生物的研究中取得的，或者是将动、植物基因转移到微生物中后进行研究而取得的，因此微生物学不仅为基因者是将动、植物基因转移到微生物中后进行研究而取得的，因此微生物学不仅为基因工程提供了操作技术，同时也提供了理论指导工程提供了操作技术，同时也提供了理论指导微生物学不仅为基因工程提供了理论基础，微生物学不仅为基因工程提供了理论基础，同时也提供了操作技术同时也提供了操作技术第二节第二节 微生物与克隆载体微生物与克隆载体将外源将外源DNA或基因片段携带入宿主细胞或基因片段携带入宿主细胞(host cell)的的工具称为载体工具称为载体(vector)作为克隆载体的基本条件：作为克隆载体的基本条件：（1）在宿主细胞内必须能够自主复制）在宿主细胞内必须能够自主复制(具备复制原点具备复制原点)（2）必须具备合适的酶切位点，供外源）必须具备合适的酶切位点，供外源 DNA片段插入，片段插入，同时不影响其复制；有一定的选择标记，用于筛选；同时不影响其复制；有一定的选择标记，用于筛选；（3）最好有较高的拷贝数，便于载体的制备。

最好有较高的拷贝数，便于载体的制备基因工程的常用载体：质粒载体质粒载体噬菌体噬菌体载体柯斯质粒柯斯质粒载体人工染色体人工染色体2022/9/307A.A.pBR322质粒载体举例常用的克隆质粒载常用的克隆质粒载体体:pBR322pBR322 pUCpUC系列系列 pGEMpGEM系列系列4363bp一、质粒克隆载体一、质粒克隆载体2022/9/308AmpAmpr rTetTetr r目的基因目的基因AmpAmpr rTeTet tr r插入灭活四插入灭活四环素抗性基因环素抗性基因pBR322pBR322BamHBamH2022/9/309B.B.pUC质粒系列 以pUC18/pUC19pUC18/pUC19为代表黏粒载体是一种由人工构建的含有噬菌体DNA的cos位点和质粒复制子的特殊类型的杂和质粒载体,具有质粒和噬菌体的双重特征，被称为cosmid，指带有粘性末端位点的质粒黏粒载体在结构组成上具有噬菌体的特性,也具有质粒载体的特性和高容量的克隆能力，一般可插入3540kb的外源基因，是构建真核生物基因文库的主要载体二、黏粒载体二、黏粒载体三、人工染色体载体三、人工染色体载体人工染色体酵母人工染色体酵母人工染色体（YACYAC）细菌人工染色体细菌人工染色体（BACBAC）利用染色体的复制元件来驱动外源利用染色体的复制元件来驱动外源DNADNA片段复制的载体称为人片段复制的载体称为人工染色体载体工染色体载体.2022/9/3013YACYAC是是酵母人工染色体酵母人工染色体（Yeast artificial chromosomeYeast artificial chromosome）的的缩写，是目前能容纳最大外源缩写，是目前能容纳最大外源DNADNA片段的载体片段的载体把酵母把酵母染色体染色体是是利用利用酿酒酵母酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)(Saccharomyces cerevisiae)染色染色体的复制元件构建的体的复制元件构建的载体。

载体YAC YAC载体是结构上能够模拟真正酵母染色体的线状载体是结构上能够模拟真正酵母染色体的线状DNADNA分子将大片段的基因组大片段的基因组DNADNA连接到连接到YACYAC载体的两个载体的两个“臂臂”上，然后将连上，然后将连接物通过转化的方法导入酵母菌，这样就构成了重组的接物通过转化的方法导入酵母菌，这样就构成了重组的YACYAC1.酵母人工染色体载体第三节第三节 微生物与基因工程工具酶微生物与基因工程工具酶基因工程所用到的绝大多数工具酶都是从不同微生物基因工程所用到的绝大多数工具酶都是从不同微生物中分离和纯化而获得的中分离和纯化而获得的一、限制性核酸内切酶一、限制性核酸内切酶能识别双链能识别双链DNA分子的特定序列，并在识别位点或其附近切割分子的特定序列，并在识别位点或其附近切割DNA的一类内切酶简称任何物种都有排除异物保护自身的防的一类内切酶简称任何物种都有排除异物保护自身的防御机制，如人的免疫系统，细菌的限制与修饰系统，即限制酶御机制，如人的免疫系统，细菌的限制与修饰系统，即限制酶(restriction enzyme)与修饰酶与修饰酶(modifying enzyme)组成的系组成的系统。

限制性酶（统限制性酶（restrition enzyme）限制酶的生物学功能一般被认为是用来保护宿主不受限制酶的生物学功能一般被认为是用来保护宿主不受外来外来DNA的感染，可降解外来的的感染，可降解外来的DNA，从而阻止其复，从而阻止其复制和整合到细胞中制和整合到细胞中1 限制酶的发现与命名限制酶的发现与命名限制性内切酶的命名遵循一定的原则，主要依据来源而定，涉及限制性内切酶的命名遵循一定的原则，主要依据来源而定，涉及宿主的种名、菌株号或生物型命名时，依次取宿主属名第一字宿主的种名、菌株号或生物型命名时，依次取宿主属名第一字母、种名头两个字母、菌株号，然后再加上序号母、种名头两个字母、菌株号，然后再加上序号(罗马字罗马字)取微生物属名的第一个字母和种名的头两个字母组成三个斜体字母加生物属名的第一个字母和种名的头两个字母组成三个斜体字母加以表示，遇有株名，再加在后面如果同一菌株先后发现几个不以表示，遇有株名，再加在后面如果同一菌株先后发现几个不同的酶，则用罗马数字加以表示同的酶，则用罗马数字加以表示EcoRI表示大肠杆菌属名第一个字母表示大肠杆菌属名第一个字母E：表示种名头两个字母表示种名头两个字母co：表示株名表示株名R：表示该菌中第一个被分离出来的酶。

表示该菌中第一个被分离出来的酶I：根据限制酶识别和切割根据限制酶识别和切割DNA的特点，可将限制酶分为的特点，可将限制酶分为I、II、III三种三种类型类型I型和型和III型限制酶无切割特异性或特异性不强型限制酶无切割特异性或特异性不强II型限制酶切割位点位于识别位点之内或在附近，特异性最强型限制酶切割位点位于识别位点之内或在附近，特异性最强2.限制酶的基本特性限制酶的基本特性识别序列通常由识别序列通常由48个碱基对组成，具有二重旋转对称轴，个碱基对组成，具有二重旋转对称轴，序列呈回文结构（序列呈回文结构（palindromic structure）所有限制酶切割所有限制酶切割DNA后，均产生含后，均产生含5 磷酸基和磷酸基和3 羟基的末端羟基的末端Hind III的识别序列：的识别序列：5-A A G C T T-33-T T C G A A-5 5-A A G C T T-33-T T C G A A-5切割后形成具有粘性末端切割后形成具有粘性末端（cohesive end）的的DNA片段：片段：限制性酶不在识别序列的对称轴上切割，而是交错切割限制性酶不在识别序列的对称轴上切割，而是交错切割结果形成结果形成5 或或3 单链突出的粘性末端的单链突出的粘性末端的DNA限制片段。

限制片段二个具有互相匹配的粘性末端的二个具有互相匹配的粘性末端的DNA片段可以通过碱基片段可以通过碱基的互补及的互补及DNA连接酶的作用而重新连接起来连接酶的作用而重新连接起来HpaI的识别序列：的识别序列：5-G T T A A C-33-C A A T T G-55-G T T A A C-33-C A A T T G-5切割后形成具有平末端（切割后形成具有平末端（blunt end）的）的DNA片段：片段：限制酶在识别序列的对称轴上切割，形成的限制酶在识别序列的对称轴上切割，形成的DNA片段片段没有突出的单链没有突出的单链具有平末端的具有平末端的DNA片段也可以在片段也可以在DNA连接酶的作连接酶的作用连接起来用连接起来不同的限制性核酸内切酶识别不同的限制性核酸内切酶识别DNA中的碱基对序列长短中的碱基对序列长短不同在随机排列的不同在随机排列的DNA序列中，识别位点序列长的限序列中，识别位点序列长的限制酶，在酶切后所得到的制酶，在酶切后所得到的DNA片段长，相反识别位点序片段长，相反识别位点序列短的限制酶，酶切后所得到列短的限制酶，酶切后所得到DNA片段短二二 甲基化酶甲基化酶 原核生物甲基化酶是作为限制与修饰系统中的一员，用于保护宿主 DNA 不被相应的限制酶所切割。

DNA聚合酶(DNA polymerase)的主要活性是催化DNA的合成(在具备模板、引物、dNTP等的情况下)真核细胞有4种DNA聚合酶，原核细胞有3种DNA聚合酶，都与DNA链的延长有关三、三、DNA 聚合酶聚合酶DNA polymerase moves along the old strand in the 3-5 direction,creating a new strand having a 5-3 direction.四四 DNA连接酶连接酶 连接酶(ligase)就是将两段核酸连接起来的酶，相当于基因工程中的“糨糊”现已发现几种不同来源或作用于不同底物的连接酶T4 DNA T4 DNA 连接酶连接酶T4 DNA 连接酶（连接酶（T4DNA ligase）的相对分子质量为）的相对分子质量为6.8104，催化，催化DNA 5磷酸基与磷酸基与3羟基之间形成磷酸羟基之间形成磷酸二酯键反应底物为黏末端、切口、平末端的二酯键反应底物为黏末端、切口、平末端的RNA（效率低）或（效率低）或DNA低浓度的聚乙二醇低浓度的聚乙二醇PEG（一般为（一般为10%）和单价阳离子（）和单价阳离。