微生物工业菌种的选育与扩大培养课件

1、1、写出生产以下产品的主要菌种： 啤酒、黄酒、味精、柠檬酸、食醋、酸奶 2、发酵工艺控制中，主要应监控 、 、 、 泡沫、氧化还原电位等。,温故知新,第三章 微生物工业菌种的选育与扩大培养,第一节 微生物工业菌种 第二节 微生物工业菌种的选育与保藏 第三节 微生物工业种子扩大培养,第一节 微生物工业菌种,野生菌 变异菌 自然选育 代谢控制育种 诱变育种 基因重组定向育种,一、发展总趋势,生长能力强、对原料要求低、原料转化率高； 选择抗噬菌体能力强的菌株； 菌种纯，不易变异退化； 菌种不是病原菌，不产生任何有害物质； 发酵副产物少，产物容易分离； 选择单产高的营养缺陷型突变株、调节突变株或野生菌株,二、选择原则,高丝氨酸 脱氢酶,不能合成,可以大量积累,人工诱变的 菌种不能产生,生产苏氨酸菌株转变成生产赖氨酸：高丝氨酸缺陷型,四大类微生物:细菌、酵母菌、霉菌和放线菌都可以用来生产工业产品。(见P8-9表1-1) 微生物的开发潜力很大。 目前人们已知的微生物只占自然界微生物总数的不到10%。而微生物代谢产物据统计已超过1300多种，但进行工业规模生产的还不到100种。,三、工业上常用微生物

2、,第二节 菌种的选育与保藏,1、菌种来源 根据资料直接向有关科研单位、高等院校、工厂或菌种保藏部门索取或购买； 通过菌种选育获得新的微生物菌种。,一、工业菌种选育,第二节 菌种的选育与保藏,2、菌种选育定义(p11) 按照生产要求，根据微生物遗传变异理论，利用自然菌 种筛选、人工诱变育种、代谢控制育种或基因重组定向育种等方法得到优良菌种的工作。,一、工业菌种选育,菌种购买指南视频,3、方法,(1)自然选育 定义 从自然界土壤、水、空气、动物、植物、矿物等样品中分离筛选得到菌种的方法。,如：土壤,如：选择培养基,如：划线分离法、稀释分离法等,饱浸含某种指示剂的滤纸片变色圈（如淀粉降解菌筛选）,指示剂直接掺入或喷洒固体培养基，菌落周围形成变色圈。如淀粉的平皿上喷上稀碘液（如淀粉降解菌筛选）,固体培养基中掺入溶解性差、可被特定菌(如磷细菌筛选) 利用的营养成分，造成不透明的培养基背景。菌落利用此物质形成透明圈。,利用有特别营养要求（如营养缺陷型菌株）作为工具菌，如待筛选菌具有合成该营养物能力，工具菌就能围绕该菌生长。,待筛选的菌株能分泌产生某些能抑制工具菌生长的物质（如抗生素产生菌筛选）,(

3、2)诱变育种 采用物理、化学诱变因素处理微生物细胞，提高基因的随机突变几率，然后通过定向筛选获得所需优良菌株。,3、方法,(3) 代谢控制育种 通过改变微生物菌种的代谢途径或代谢自动调节系统（如增加特定基因拷贝数来提高限速酶含量）而使微生物发生异常代谢，使所需中间代谢产物过量积累。,3、方法,生物进化过程中微生物形成完善的代谢调节机制,代谢产物不会过量积累,解除或控制微生物的代谢调节,目的产物积累,(4) 基因重组定向育种 通过转化、转导、杂交和原生质体融合等遗传学方法和技术定向地重组微生物DNA，使微生物的功能发生定向的改变。,3、方法,让生命永存一37-43 微生物学第六章,4、方法,基因重组定向育种先进技术能取代传统育种方法吗？,先进育种技术需在优良原始菌种基础上应用才有效。 基因重组产品主要还是一些较短的多肽和小分子蛋白质。 蛋白质类以外的很多发酵产物（如糖类、有机酸及次级代谢产物等）产生往往受到多个基因的控制，尤其是还有许多发酵产物的代谢途径还没有被确证。,1、菌种衰退的概念 指菌种整体在多次接种传代过程中逐渐造成生产能力降低，表现为发酵力（如对培养基的利用）或繁殖力（如孢子

4、的产生）下降或发酵产物得率降低的现象。,二、工业菌种的衰退与防止,2、菌种衰退的常见现象 菌落和细胞形态的改变 生长速度缓慢，产孢子越来越少 抵抗力、抗不良环境能力减弱等 代谢产物生产能力或其对宿主寄生能力下降,二、工业菌种的衰退与防止,3、菌种衰退产生的原因 保藏不恰当 传代次数过多 发生回复突变 培养条件不适合,二、工业菌种的衰退与防止,4、防止菌种衰退的方法 作好菌种保藏工作 尽可能使每次培养条件适合而一致 尽量减少传代次数 应使用幼龄菌培养,二、工业菌种的衰退与防止,三、菌种的复壮,概念 狭义：在菌种已衰退情况下，通过纯种分离和生产性能测定等方法，从衰退群体中找出少数未衰退的个体，以恢复原有典型性状的措施。 广义：在菌种未衰退前经常有意识地进行纯种分离和生产性状测定工作，以期从中选择到自发的正变个体。,衰退菌种复壮的方法 单细胞菌株分离法 沸水筛选法 菌液用沸水处理后进行单细胞菌株分离，从而挑选出优良菌体。 改变培养条件法 采用有利于高产菌株而不利于低产菌株的条件来选出高产菌株。 通过宿主体复壮 如Bacillus thuringiensis的复壮 诱变处理法 对发生回复突变进

5、行重新诱变育种。,三、菌种的复壮,1、原理 根据菌种的生理、生化特点，人为地创造条件，使菌种的代谢活动处于不活泼状态(最好是休眠状态)。,四、工业菌种的保藏,2、原则 挑选优良纯种，最好是休眠体（如孢子、芽孢等），创造一个最有利于休眠的环境条件（如低温、干燥、缺氧、营养物质缺乏等），就可以达到菌种保藏的目的。同时，作为可行的方法，还要考虑方法的经济和简便。,三、工业菌种的保藏,斜面低温保藏法 菌种在斜面培养基上培养，生长旺盛后存放在4-8的冰箱中，一般半年要移植一次。适合保藏实验室常用菌种。 低温冰箱保藏法 菌种经液体培养后，加入无菌甘油，使甘油含量为30-40%，置于-80低温冰箱中保存，保存期为1-10年。适用于保存各类微生物菌体。 石蜡油封保藏法 医用石蜡油灭菌冷却后加在斜面菌种上,超过斜面顶部1cm，在室温下或冰箱里可保存1-10年。几乎所有微生物都适用。,三、工业菌种的保藏 3、方法,砂土保藏法 将干的孢子、芽孢与彻底灭菌的砂土混合后装入砂土管，放入装有吸湿剂的干燥器或大试管中，加橡皮塞用蜡封严，置阴凉干燥处或冰箱中可保藏1-10年。适合于孢子、芽孢等的保存。 冷冻干燥保藏法 瓶中加入菌体或孢子悬液，-40低温冰箱冷冻1h，室温真空干燥固封，可保存10-数10年。适用于保存各类微生物菌体。保存运输方便。,液氮超低温保藏法 菌种密封于安踣瓶中, 慢速冻结器中以每分钟下降1的速度下降到-35，再迅速降温至-196，并在该温度下的液氮超低温罐中保存，保存期为3-9年。适用于保存各类微生物菌体。,第三节 微生物工业种子扩大培养,获得活力旺盛的、接种数量足够、纯而壮的培养物。,一、目的与任务,种子扩大培养是指将保存在砂土管、冷冻干燥管中处休眠状态的生产菌种接入试管斜面活化后，再经过扁瓶或摇瓶及种子罐逐级扩大培养,最终获得一定数量和质量的纯种过程。,斜面,摇瓶,种子罐,发酵罐,二、工艺,斜面菌种一级种子摇瓶培养二级种子罐培养发酵罐 （二级） 斜面菌种一级种子摇瓶培养二级种子罐培养三级种子罐培养发酵罐 （三级） 尽量采用二级发酵,三、级数的确定,菌种发展总趋势，如何理解 工业菌种选育的定义、方法 工业菌种衰退的定义、防止方法 菌种复壮的概念与方法 工业菌种保藏原则与方法 工业菌种扩大培养工艺与级数,课后思考题,？,

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