高效液相色谱仪
96页1、第二部分高效液相色谱仪及简单操作维护,HPLC技术的发展过程,HPLC是经典液相色谱的发展,同时是气相色谱理论的扩展和延伸。二十世纪60年代末期生产出商品化液相色谱仪,其发展非常快速,经过30多年的努力已成为分离学科中的骨干技术。目前,HPLC技术已趋于成熟。特点:采用高压泵、高效填料、高灵敏度检测器实现了快速、高效和操作自动化。,HPLC和经典液相色谱法的比较,高效液相色谱法的特点,(1)分离效能高:柱效可达500030000块/米(2)选择性高:通过流动相的控制来改善分离过程的选择性(3)检测灵敏度高: UV最小检出量可以达到10-9 g FD-最小检出量可以达到10-12 g(4)分析速度快:采用了高压泵,流动相和储液罐,(1)储液罐 材质:玻璃、不锈钢、氟塑料或特种塑料聚醚醚酮(PEEK) 棕色玻璃瓶会避免藻类的生长 容积:0.52.0L 放置位置:高于泵体,保持一定的输液静压差 注意:密封、过滤,(2)流动相-使用限制,避免使用下述可腐蚀钢铁的溶剂: 碱金属卤化物及其酸溶液,如:碘化锂、氯化钾等 高浓度无机酸,如硝酸、硫酸. 可能含有过氧化物的色谱纯醚(如THF、二氧六环、二
2、丙基乙醚) 在使用前必须用干燥氧化铝过滤除去过氧化物 含强络合剂的溶液,如EDTA,乙二胺四乙酸 四氯化碳与2-异丙醇或四氢呋喃的混合液,(2)流动相-过滤,流动相过滤的目的 过滤去除可能存在的微小固体颗粒 保护色谱高压泵和色谱柱流动相过滤方法 在线溶剂过滤 抽真空过滤,流动相 在线过滤:,清洁方法:1、用水冲洗残留溶剂后,将过滤器放在约35浓硝酸里浸一小时2、用二次蒸馏水彻底冲洗过滤器3、将过滤器重新装好。4、定期清洗溶剂过滤器及溶剂瓶 (每13个月至少清洗一次),不能用超声波清洗,流动相 抽真空过滤,过滤用膜:水系和有机,孔径:0.22m和0.45m,流动相脱气的目的使色谱泵的输液准确输液均匀准确,并且脉动减小保留时间及色谱峰面积的重现性提高提高检测的性能防止气泡引起的尖峰基线稳定,信噪比增加溶剂的紫外吸收本底降低保护色谱柱减少死体积防止填料的氧化,(2)流动相- -脱气,常用的脱气方法有:抽真空脱气法: 特点:可以一次完成过滤和脱气任务 注意:抽真空会引起混合溶剂组分的变化,适合单一溶剂体系超声波脱气法 简单,但效果不理想,常用的脱气方法(续)在线真空脱气法,流动相的要求:,(1
3、)使用新鲜配制的流动相,特别是水溶剂或盐缓冲液建议不超过两天,最好每天更换,流动相:water/methanol/trifluoroacetic acid(50/50/0.1)a:freshb:after three hoursc: after eight hours,流动相的要求:(2)互溶性,流动相的要求:(3)紫外吸收,甲醇和水210nm,甲醇和水254nm,乙腈和水210nm,乙腈和水254nm,流动相的要求:(4)pH的影响,高压输液泵和梯度洗脱装置,性能:泵体材料耐化学腐蚀 能在高压下连续工作 输液流量范围宽 对填充柱:分析型输出流量为0.110 ml/min 制备型输出流量为1100 ml/min 对微孔柱:分析型输出流量为101000 l/min 制备型输出流量为19900 l/min 输出流量稳定、重复性高 流量控制的精密度应小于1%(最好为0.5% ),重复性 最好为0.5%,高压泵的分类,往复型泵 目前使用的是双柱塞往复式并联泵和双柱塞往复式串联泵,双柱塞往复式串联泵示意图,输液系统的辅助设备 主要有管道过滤器、脉动阻尼器、由压力传感器组成的压力测量、显示装置,以
4、及流动相流量的测量装置,梯度洗脱装置 梯度洗脱技术可以提高柱效、缩短分析时间,改善检测器的灵敏度,它类似于GC种使用的程序升温技术 影响梯度洗脱的主要因素有:溶剂的纯度、溶剂的互溶性、检测器的种类,四元低压梯度系统,四元高压梯度系统,泵操作注意事项,设定泵运转时的高、低压极限2. 缓冲盐溶液与有机溶剂转换时必须用去离子水清洗泵 3. 缓冲盐溶液的浓度不能过高,pH范围113,Cl-的浓度小于0.1mol/L4. 清洗柱塞,注意事项:1、 必须设定高、低压极限2、 缓冲溶液与有机溶剂转换时用去离子水清洗泵 3、缓冲盐溶液的浓度不能过高,pH范围113,Cl-的浓度小于0.1mol/L;, 经常使用,每周至少更换一二次(95%的水) 很少使用则每次使用前必须更换,泵压力不正常的主要原因: 气泡,主动阀故障,出口阀故障,密封垫或柱塞杆磨损,渗漏或堵塞,比例阀故障,传感器故障,使用比例阀混合时盐浓度太高,进样装置 六通阀进样装置,六通阀进样装置 正面,六通阀进样装置 反面连接,7725i型六通阀的特点旋转操作时不中断流速可部分充满(可变),也可全部充满(固定)loop孔角度较宽,改善了操作的容
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