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精编制作血清γ-球蛋白的分离、纯化(实验六)PPT课件

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卖家[上传人]：ahu****ng1

文档编号：127492591

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1、血清球蛋白的分离纯化实验原理 1 了解并初步掌握盐析法分离纯化蛋白质的原理 2 熟悉盐析法分离纯化蛋白质的方法实验原理一蛋白质盐析在水溶液中蛋白质分子由于表面生成水化层和同性电荷层而成为稳定的亲水胶体颗粒因此蛋白质在水溶液中比较稳定而不易沉淀当加入较高浓度的中性盐时这些盐类与水有亲和性与蛋白质争夺水分破坏蛋白质颗粒表面的水化膜同时由于这些盐是强电解质离子浓度相对的比较高可以大量中和蛋白质颗粒上的电荷这样使蛋白质成了既不含水膜又不带电荷的不稳定颗粒而容易沉淀这就是利用盐析沉淀蛋白质的基本原理由于血清中各种蛋白质所带电荷多少颗粒大小及亲水程度都不一样因此使用某种中性盐进行盐析时所需要的盐浓度也各不相同 50 饱和度的硫酸铵能使血清中的球蛋白沉淀而33 饱和度的硫酸铵则使球蛋白沉淀可根据所要分离的蛋白质选择不同饱和度的硫酸铵溶液进行盐析二浓缩一般实验室常用的是透析袋半透膜浓缩半透膜具有选择透过性只允许离子和小分子扩散进出生物大分子蛋白质等不能自由通过半透膜将待浓缩的蛋白质溶液放入透析袋内用绳子扎紧然后置于烧杯中

2、实验试剂与器材试剂 1 小牛血清 2 PBS pH7 2磷酸盐缓冲生理盐水 3 3 BaCl2溶液 4 pH7 2饱和硫酸胺溶液器材 1 离心管 2 离心机 3 移液管 4 透析袋实验步骤一盐析中性盐沉淀离心管加入血清2ml 2mlPBS 摇匀逐滴加入pH7 2饱和硫酸胺溶液7ml 边加边摇静置10min 离心 3000转分 10min 弃上清液沉淀 1 0mlPBS使之溶解逐滴加饱和硫酸胺1 5ml 摇匀静置10min 离心 3000转分 10min 弃上清液沉淀球蛋白二浓缩将上述收集的蛋白质 1mlPBS 沉淀完全溶解后放入透析袋内用绳子扎紧然后置于100ml烧杯中加入纯净水 3 5min后取1ml烧杯中溶液至试管中再滴加BaCl2若出现白色混浊将烧杯中的水倒掉再换上纯净水直至滴加BaCl2溶液不再出现白色混浊为止注意事项 1 在盐析时饱和硫酸铵应逐滴加入速度不能过快一定要边滴加边搅拌以减少局部高浓度硫酸铵所引起的共沉现象搅拌速度不宜过快以免产生过多泡沫致使蛋白质变性 2 硫酸铵浓度越高越容易沉淀但浓度过高容易引起其他杂蛋白的共沉作用因此必须根据分离蛋白的浓度要求控制适当的蛋白质浓度 3 离心时应平衡放置离心管 4 浓缩时滴加BaCl2前先取出透析袋再滴加 5 更换蒸馏水的目的是为了增大半透膜两边的浓度差思考题 1 为何硫酸胺能沉淀蛋白质第一次盐析时硫酸胺的饱和度是多少沉淀的是何种蛋白质使沉淀溶解再次盐析的目的是什么 2 用硫酸胺分段沉淀蛋白质时透析袋外液体会出现蛋白质吗你能否做一个小实验加以证实并说明实验原理

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