聚肌胞对人早孕绒毛外滋养细胞tlr3表达的调节作用

1、 聚肌胞对人早孕绒毛外滋养细胞 TLR3 表达的调节作用 作者：王菊 1,钟刚 2 作者单位：1 518106 广东深圳，深圳市光明新区公明人民医院妇科 2 广东深圳，华中科技大学同济医学院附属同济医院【摘要】目的 通过体外实验研究 Toll 样受体 3(TLR3)在人早孕绒毛外滋养细胞株 TEV- 1 的表达及聚肌胞 PolyI:C 对 TLR3 mRNA 和蛋白的调节作用。方法 体外培养 TEV-1 细胞; 用不同时间及浓度聚肌胞刺激 TEV-1 细胞后 RT-PCR 和流式细胞仪检测其 TLR3 mRNA 和 蛋白的表达变化;免疫细胞化学 SP 染色法检测 TLR3 蛋白的定位表达。结果 (1)PolyI:C 刺 激可上调 TEV-1 细胞株 TLR3 mRNA 的表达(P 0.01)，且与刺激时间和剂量呈正相关。(2) PolyI:C 刺激可上调 TEV-1 细胞株 TLR3 蛋白表达的平均荧光强度(P 0.01);但荧光阳性细胞 数刺激 12h 与刺激前比较差异无显著性(P 0.05);刺激 24h、48h 的荧光阳性细胞数与刺激时 间和剂量呈正关(24h P 0.05;48

2、h P 0.01)。(3)免疫细胞化学显示 TLR3 主要定位于 TEV-1 细 胞株的细胞浆。结论 TEV-1 细胞株 TLR3 的 mRNA 及蛋白的表达与 Poly(I:C) 刺激时间及 剂量呈正相关;TLR3 主要定位于 TEV-1 细胞株的细胞浆，而细胞核及细胞膜没有观测到明 显表达。提示人早孕绒毛外滋养细胞可能通过细胞浆的 TLR3 参与早孕母-胎界面的免疫反 应。【关键词】 TLR3;Poly(I:C);TEV-1 细胞株;流式细胞仪;平均荧光强度;荧光阳性细胞数;免 疫细胞化学Abstract Objective To investigate the regulatory effect of PolyI:C on the expression of TLR3 mRNA and protein in the human extravillous trophoblast cell line (TEV-1)，and whether the regulatory effect depends on PolyI:C s dose and time.Methods Semi-qua

3、ntitative RT-PCR analysis，flow cytometry and immuo-cytochemistry were used to dedect TLR3 mRNA and protein expression level and location in TEV-I cell line.Results (1)The expression of TLR3 mRNA in TEV-I cell line significantly increased with the PolyI:C s stimulation time and dose increase; compare to without PolyI:C s stimulation(P 0.01).The mean fluorescence intensity of the TLR3 protein in TEV-I cell line increased with the PolyI:C s stimulation time and dose increase; compare to without Pol

4、yI:C s stimulation(P 0.01).(2)The number of fluorescence positive cell of the TLR3 protein stimulated 12 hour had no statistics significance(P 0.05); But its increased with the stimulation time and dose increase in 24 and 48 hour intervention(24h P 0.05 ; 48h P 0.01).(3)The Immuocytochemistry result revealed that TLR3 protein was expressed in TEV-I cell line s cytoplasma.However，it s hardly to see the expression in the cellular membrane and nucleus.Conclusion TLR3 protein was expressed in TEV-I

5、cell line and localized to the cytoplasma.The increase of mRNA and protein expression of TLR3 in TEV-I cell line depends on the increase of the dose and time for PolyI:C s stimulation.Key words TLR3，PolyI:C;TEV-I cell line; flow cytometry; average fluorescence intensity; the number of fluorescence positive cell正常妊娠时母-胎界面存在着很强的免疫反应，其主要作用是促进胚胎植入和调节胎盘 的发育，使母体对半异体来源的胎儿、胎盘产生耐受;同时，维持宿主防御反应，从而阻止 病原微生物对机体组织和妊娠的破坏。母胎界面处的滋养细胞、免疫活性细胞及细胞因子， 构成了母-胎界面的免疫微环境，对于妊娠的建立、维持、胎儿的生长发育以及分娩发动起 着重要作用1。而妊娠病理(如:反复自发性流产、早产、

6、子痫、胎膜早破、IUGR 等)则与母-胎界面的免疫微环境的改变有关2。因此，母-胎界面处细胞生物学和分子免疫学的研 究已成为医学研究的热点之一。天然免疫性细胞是可以通过对病原体表达的病原体相关分子模式识别各种病原体的。 Toll 样受体是近年来发现的重要的免疫受体，它在天然免疫中通过对病原体相关的分子模 式(pathogen-associated molecular patterns，PAMP)的识别发挥作用，通过刺激信号的级联反 应导致细胞因子的产生和协同刺激因子的表达，从而在天然免疫和获得性免疫中起到了桥 梁的作用3。近年来的研究进展还发现 Toll 样受体也广泛表达于女性生殖系统及母-胎界 面，在局部抗感染、生殖免疫、妊娠免疫的生理及病理过程中发挥着重要作用4，5。本 研究采用 RT-PCR、流式细胞仪检测及免疫细胞化学 SP 法染色法测定 Toll 样受体 3(TLR3) 蛋白在人早孕绒毛膜外滋养细胞株(TEV-1)的定位及基因、蛋白表达和聚肌胞对其表达的影 响，从而探讨 TLR3 在母-胎界面的表达及免疫作用。1 材料与方法1.1 细胞株来源 人早孕绒毛外滋养细胞株 TEV-

7、1 由香港大学馈赠。1.2 试剂单克隆小鼠抗人 TLR3 一抗：美国 Santa Cruz 生物技术公司;羊抗小鼠 IgG 荧光二抗 (FITC 标记)：购自美国 KPL 生物技术公司;引物：由上海博亚公司合成;Poly(I:C)：美国 Sigma 生物技术公司。1.3 方法1.3.1 细胞培养TEV-1 细胞株接种于细胞培养瓶，用 DMEM/F12 培养液及 10%胎牛血清的混合液 45ml 在培养箱中培养。待 80%融合后，吸掉旧培养基，D-Hanks 液洗涤细胞 1 次，0.25%胰 蛋白酶消化 12min，在倒置显微镜下观察，当细胞将分离而呈圆粒状时，立即加入适量 含血清的新鲜培养基终止胰蛋白酶的作用。再用吸管反复吹打细胞培养瓶壁使细胞脱落， 并把细胞吹散至均匀。然后依 1：3 的比例转移至新的培养瓶中，以上述条件培养。1.3.2 流式细胞仪检测 TLR3 蛋白在 TEV-1 细胞株的表达将 TEV-1 细胞株种植于 7 个培养皿中培养，生长至 80%融合后换成 1ml 的 optin -MEM 培养液培养。6 个培养皿中分别加入 poly(I:C)12 g、25 g 及分别培

8、养 12、24、48h，另一培 养皿则不加。然后制成细胞悬液，无水乙醇固定，加入 50 l 0.2% TritonX100 破膜，PBS 洗 2 次。加 BSA 稀释的单克隆小鼠抗人 TLR3 一抗 100 l，4过夜，PBS 洗 2 次。加 BSA 稀释的羊抗小鼠 IgG 荧光二抗(FITC 标记)100 l，4孵育 30min，PBS 洗 2 次,标本置流式 细胞仪上检测。1.3.3 RT-PCR1.3.3.1 RNA 的提取参照 TRIZOL 试剂盒(美国 GIBCOBRL 公司)说明书进行提取 RNA。1.3.3.2 逆转录 cDNA 合成将 RNA 稀释为 1 g/ l，取 2 l RNA 加入 1 l Oligo (dT)15 (0.5 g/ l)、DEPC-H2O 7 l，充分 混匀后，离心，在 70孵育 5min，迅速置于冰上，3min 后离心;加入 5 Reaction Buffer 4 l，dNTP Mix(10mmol/L)1 l，M-MLV Reverse Transcriptase(Promega 公司，200U/ l)1 l，DEPC-H2O 4 42孵育

9、60min;95孵育 10min 灭活逆转录酶活性，然后置 4以备作 PCR 用。1.3.3.3 引物设计 见表 1。表 1 -actin 和 TLR3 引物序列1.3.3.4 聚合酶链式反应(PCR) 扩增体系：10 Taq Buffer 5 l，MgCl2(25mmol/L) 3 l，dNTP Mix(10mmol/L)1 l，引物各(10 mol/L)1 l，cDNA 2 l，Taq 聚合酶(1U/ l)1 l，DEPC-H2O 36 95预变性 5min，94变性 45s，54.4退火 45s，72延伸 1min，30 个循环，72终末延伸 10min。1.3.3.5 琼脂糖凝胶电泳 75V 电压下 2%琼脂糖凝胶电泳 40min，紫外灯下观察条带。1.3.3.6 采用英国 UVP 公司 GDS-8000 型全自动凝胶成像分析仪扫描 DNA 条带灰度值， 用软件分析条带灰度比值。1.3.4 免疫细胞化学 SP 法染色 将盖玻片置于细胞培养皿，将 TEV-1 细胞株接种于其中， 放入细胞培养箱培养进行细胞爬片;取出细胞爬片冰丙酮固定 20min，细胞面向上固定于载 玻片上;3%H2O2 封闭内源性酶;5%的正常山羊血清封闭;以 1：100 浓度稀释的单克隆鼠抗 人 TLR3 一抗湿盒内 4孵育过夜;苏木素复染后脱水、透明、中性树胶封片。HMIAS-2000 高清晰度彩色医学图文分析系统拍照。1.3.5 统计学处理 所有数据均以均数 标准差(x s) 表示,用 SPSS 11.5 统计软件进行数据 分析,组间比较采用 LSD 检验。2 结果2.1 TLR3 mRNA 的表达及变化 TLR3 mRNA 的表达随刺激时间及剂量的梯度的上升而 增加，与刺激前比较，P 0.01(见图 1、表 2)。1 泳道为刺激前结果;2 泳道为 12 g、12h 结果; 3 泳道为 25 g、12h 结果;4 泳道为 12 g、24h 结果;5 泳道为 25 g、24h 结果;6 泳道为 12 g、48h 结果; 7 泳道为 25 g、48h 结果;M 为 Marker;530bp 为 -actin 扩增片段;334bp 为 TLR3 扩增片段图 1 TLR3 的 RT-PCR 扩增产物检

《聚肌胞对人早孕绒毛外滋养细胞tlr3表达的调节作用》由会员kms****20分享，可在线阅读，更多相关《聚肌胞对人早孕绒毛外滋养细胞tlr3表达的调节作用》请在金锄头文库上搜索。