Sanger测序流程--精选文档
4页1、Sanger测序一、原理Sanger法测序是利用一种DNA聚合酶来延伸结合在待定序列模板上的引物,直到掺入一种链终止核苷酸为止。每一次序列测定由一套四个单独的反应构成,每个反应含有所有四种脱氧核苷酸三磷酸(dNTP),并混入限量的一种不同的双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)。由于ddNTP缺乏延伸所需要的3-OH基团,使延长的寡聚核苷酸选择性地在G、A、T或C处终止并且在每个碱基后面进行荧光标记,产生以A、T、C、G结束的四组不同长度的一系列核苷酸,然后在尿素变性的PAGE胶上电泳进行检测,从而获得可见的DNA碱基序列。 ABI 3730XL测序仪是高质量的长片段读取和序列分析的测序平台,应用灵活而广泛,可同时分析96个样品。该仪器采用4色荧光同时检测,可不间断24小时运行,自动灌胶,上样,电泳分离,检测及数据分析。二、技术路线三、操作流程1、DNA的提取一般采用试剂盒提取(参考试剂盒提供的protocol)。2、PCR扩增与电泳 配置PCR体系(25ul体系)DNA浓度大于30ng/ul(DNA浓度需要测定): 试剂名称用量H2O15.2l10*PCR buffer2.5l2.5Mm d
2、NTPs3lprimer(前后引物各1ul)2lLA Taq酶0.3lDNA模板2l注意: 对于CEBPA和NOTCH1此类GC含量高的将10*PCR buffer 2.5ul换为2*GC buffer 12.5ul, H2O 为5.2ul。每次96孔板加样后都必须贴封口膜,离心混匀(2000g 1min), 防止挂壁。EP管与96孔板等都为商品型一次性产品, 注意标记板号, 样本号和引物号。 设置PCR反应程序一般程序:96预变性2min, 96 30s, 57 30s, 72 2min, 35cycles; 72延伸5min; 4/15。CEBPA和NOTCH1程序:96预变性5min, 95 40s, 64/66 40s, 72 1min, 35cycles; 72延伸5min; 4/15。 琼脂糖凝胶电泳配置1.5%(60ml 0.9g, 大胶板150ml 2.25g)的琼脂糖凝胶, 再分别取2ul loading buffer与4ul DNA扩增产物混合后进行电泳, 160V 35min。3、PCR产物纯化 配制消化液TaKaRa Alkaline Phosphatase 虾
《Sanger测序流程--精选文档》由会员m****分享,可在线阅读,更多相关《Sanger测序流程--精选文档》请在金锄头文库上搜索。
免疫学简答题
实际问题与一元二次方程第二课时同步练习含答案
儿科512护士节演讲稿范文
疫情督查整改和复工复产问题报告
微生物基本术语
必备房屋出租合同范文汇总10篇
父母要时常陪伴孩子经常交流
2023实习个人总结标准样本(2篇).doc
公司管理者的年度工作总结
食品采购合同参考样本(6篇).doc
中位数和众数说课稿 (2)
成都农村宅基地赠与协议书简单版(四篇).doc
幼儿园中班社会教案送给老人的礼物
金融资产转移相关资料
桥工程施工设计方案
2023年幼儿园保育员年终个人工作总结(9篇)
精选调解协议书4篇
苏教版科学四上文档
2023年倾听重要性(全文完整)
吉林省长外国语学校高二物理下学期第一次月考试题05111136
2023-03-07 3页
2022-11-18 11页
2023-01-04 27页
2022-09-12 39页
2023-10-06 3页
2022-10-03 18页
2023-08-03 7页
2022-08-10 6页
2023-03-05 4页
2023-12-06 15页