21固相析出分离技术

1、2.1 固相析出分离技术 通过加入某种试剂或改变溶液条件，使生化产物以固体形式从溶液中沉降析出的分离纯化技术称为固相析 出分离技术。根据析出物的形态不同分为结晶法（结晶析出）和沉淀法（无定形固体析出） 第一节 沉淀分离技术 沉淀法也称溶解度法，其纯化生物大分子的原理是根据物质的结构差异（如蛋白 质分子表面疏水基团和亲水基团比例的差异）来改变溶液的某些性质（如pH值、极性、离子强度、金属离 子等），使抽提液中有效成份的溶解度发生变化，从而达到从抽提液中分离有效成份的目的。一、盐析沉淀法1. 盐析的原理定义：一般在低盐浓度的情况下，蛋白质的溶解度随盐浓度的升高而增加，这种现象称为盐 溶；而当盐浓度升高到一定程度后，蛋白质的溶解度又随着盐浓度的升高而降低，结果使蛋白质沉淀析出， 这种现象称为盐析作用。在同一浓度的盐溶液中，不同蛋白质的溶解度不同，借此可达到彼此分离的目的。 原理：盐浓度增高到一定数值后，水活性降低，导致蛋白质分子表面电荷逐渐被中和，水化膜相继被破坏 最终引起蛋白质分子间相互聚集并从溶液中析出。 盐能够改变蛋白质的溶解度，蛋白质的溶解度与溶液中离子强度有密切关系。两者的关系可用

2、下式表示： lg （S/So）= -KsI S为蛋白质在离子强度为I时的溶解度（g/L） ； So为蛋白质在离子强度为0时的溶解 度； Ks 为盐析常数； I 为离子强度。在温度一定的条件下，某一蛋白质在某一 pH值的水溶液中的溶解度为一常数So。故上式可 改写为：lgS = lgSo - KsI = B - KsI 0 =lgSo为一常数0值主要取决于蛋白质的性质，也与溶液的温度和pH值有 关；盐析常数Ks主要与盐的性质（离子价数、平均半径等）和蛋白质的结构有关，Ks越大，盐析效果越 好。所以对某一蛋白质来说，在温度和pH值等盐析条件确定（即0确定），所采用的盐确定（即Ks确定）以后， 蛋白质的溶解度决定于离子强度1,1可用下式计算：I = 1/2 EmiZi2m :溶液中离子的摩尔浓度Z :离子的价数对于多种蛋白质或酶的混合液，可采用分段盐析法进行分离纯化。 ii2. 盐的选择：蛋白质的盐析通常采用中性盐，如硫酸铵、硫酸钠、硫酸镁、氯化钠、磷酸钠等，其中应用 最广的是硫酸铵。 硫酸铵是一中性盐，对蛋白质有相当好的安定作用。又因为其离子容积较大，吸走水分 子的能力也大，成为有效的盐析

3、工具。硫酸铵在水中的溶解度大而温度的影响小 （25 C时溶解度为4.1mo l/L，即767g/L;0C时溶解度为 3.7mol/L，即697g/L），而且价廉易得，不易引起蛋白质变性，分离效果比其他盐好。 但是用硫酸铵盐析时，缓冲能力较差，而且铵离子会干扰蛋白氮的测定，故有时也要用其他盐来进行盐析。 磷酸钾和硫酸钠的盐析系数Ks较大，但由于在较低温度下的溶解度太低,受温度影响大，故应用不广泛。3. 硫酸铵浓度的计算与调整方法 :通常硫酸铵的添加以百分饱和度來表示 （不是浓度百分比），例如大部分蛋白质可在 80% 硫酸铵饱和度下 沉淀。因为硫酸铵加入的体积很大，会改变最后的总体积，很难由浓度百分比來計算，因此使用百分饱和 度作为沉淀蛋白质的度量。用硫酸铵进行盐析时，蛋白质溶液中硫酸铵浓度的调整方法主要有二种 ：（1）加入饱和溶液法 要求：蛋白质溶液体积不大，所需调整的硫酸铵浓度不高V= V （S-S）/ （1-S）V:所需加进的饱和硫酸铵溶液的体积；V:原溶液体积；S :所需达到的硫酸铵 0 2 1 2 0 2饱和度；帚原溶液的硫酸铵饱和度。饱和硫酸铵的配制方法：在一定量的水中加入过量

4、的硫酸铵，加热至50-60C，趁热滤去沉淀，再在0C 或室温平衡12天，有固体析出时达100饱和度。2） 加入固体盐法要求：饱和度高，不增大溶液体积t=G（S2-S1）/（1-AS2）S2, S1:分别代表所需达到的硫酸铵饱和度和原溶液的硫酸铵饱和度；t：将1LS1 饱和度的溶液提高到S2饱和度时所需加进的硫酸铵克数；G,A：常数，与温度有关。实际使用时，t可直 接查表得到。（注意：0C，25C两张表，室温用25C）4. 影响蛋白质盐析的因素：（1）蛋白质浓度 蛋白质浓度高时，欲分离的蛋白质常常夹杂着其他蛋白质一起沉淀出来（共沉现象）。因此在盐析前要加等 量生理盐水稀释，使蛋白质含量在 2530g/L。（2）离子强度和离子类型的影响a.离子强度增加，溶解度下降，盐析易发生 b.不同蛋白质盐析时所需离子强度不同，可采用分步盐 析，通过逐步增加离子强度，使不同蛋白分步沉淀出来c.离子强度相同时，高价离子，半径小的离子盐析 力强3）pH的影响大多数蛋白质在等点电时，在盐溶液中的溶解度最低。所以盐析时溶液pH值调到等电点效 果最好。（4）温度的影响a.在低离子强度或纯水中，温度升高，溶解度增加

5、；b.在高盐溶液中，温度升高，溶 解度降低。一般在室温下进行盐析;温度敏感的蛋白质在低温4C进行;也有个别酶在低温时失活，高温有活性，如血红 蛋白、肌红蛋白、清蛋白在25C比0C时溶解度低，更容易盐析。实际使用：制备初期：pH，温度一定，改变盐浓度（离子强度）（Ks分段盐析）；纯化，结晶：离子强度一定，改变pH，温度（0分段盐析）lgS = lgSo - KsI = B 一 KsI5盐析时的注意事项：（1）添加的硫酸铵的纯度要高，添加后，要放30min以上使其充分溶解，且要不断 搅拌，防止局部过浓，发生共沉淀；（2）同一溶液中欲分离几种蛋白质时，可采用分段盐析的方法。盐析 通常与等电点沉淀法配合使用。 （3）选择好温度，一般在室温下进行； （4）蛋白浓度不易过高，一般25 30g/L；低浓度盐析，可用离心分离；高浓度盐析（70 80%），用过滤（因为粘度大，离心操作慢）；盐析 沉淀得到的蛋白质含量较高，纯品需经脱盐处理，如透析，凝胶过滤等。二、有机溶剂沉淀法（一）作用机理：（1）降低水溶液的介电常数，使溶质溶解度降低；（2）破坏大分子周围水膜，使溶解度降低。利用不同蛋白质在不同浓度的有

6、机溶剂中的溶解度不同而使蛋白质分离的方法，称为有机溶剂沉淀法。经 常使用的有机溶剂是乙醇和丙酮。优点：比盐析法析出的沉淀容易过滤或离心分离，分辨力比盐析法好，溶剂也容易除去。缺点： 有机溶剂沉淀法易使蛋白质和酶变性，所以操作必须在低温条件下进行。蛋白质和酶沉淀分离后， 应立即用水或缓冲液溶解，以降低有机溶剂浓度，避免变性。成本较高，有一定的危险性。 中性盐可减 少有机溶剂引起的蛋白质变性，提高分离效果，一般添加0.05mol/L的中性盐。由于中性盐会增加蛋白质 在有机溶剂中的溶解度，故中性盐不宜添加太多。 有机溶剂沉淀法一般与等电点沉淀法联合使用。即操 作时溶液的pH值应控制在欲分离蛋白质的等电点附近。注意事项：（1） 低温操作（2）样品浓度过大，易变性，共沉淀作用大，分离效果差；过小，易产生变性， 回收率低。（3）样品稳定结构范围内，选择溶解度最低处的pH，即与等电点共沉淀结合使用。（4）注意 离子强度，离子种类的影响。（二）有机溶剂的选择和浓度的计算 用于生化制备的有机溶剂的选择首先是要能与水互溶。沉淀蛋白质和酶常用的是乙醇、甲醇和丙酮。为了 获得沉淀而不着重于进行分离，可用溶液体

7、积的倍数：如加入一倍、二倍、三倍原溶液体积的有机溶剂， 来进行有机溶剂沉淀。（三）有机溶剂沉淀的影响因素 1 温度：多数生物大分子如蛋白质、酶和核酸在有机溶剂中对温度特别 敏感，温度稍高就会引起变性，且有机溶剂与水混合时产生放热反应，因此必须预冷，操作要在冰盐浴中 进行，加入有机溶剂时必须缓慢且不断搅拌以免局部过浓。 一般规律是温度越低，得到的蛋白质活性越 高。 2. 样品浓度：低浓度样品回收率低，要使用比例更大的有机溶剂进行沉淀。高浓度样品，可以节省 有机溶剂，减少变性的危险，但杂蛋白的共沉淀作用大。通常使用5mg/mL20mg/mL的蛋白质初浓度为宜。3 pH 值：选择在样品稳定的 pH 值范围内，通常是选在等电点附近，从而提高此沉淀法的分辨能力。4 离子强度：盐浓度太大或太小都有不利影响，通常盐浓度以不超过 5为宜，使用乙醇的量也以不超过原蛋白质水溶液的2倍体积为宜，少量的中性盐对蛋白质变性有良好的保护作用，但盐浓度过高会增加蛋 白质在水中的溶解度，降低了沉淀效果，通常是在低浓度缓冲液中沉淀蛋白质。5其他金属离子 一些金属离子如Ca2+,Zn2+等可与某些成阴离子状态的蛋白质形成

8、复合物，从而降低溶解 度而不影响其活性，有利于沉淀形成，并降低溶剂用量。注意：沉淀所得的固体样品，如果不是立即溶解 进行下一步的分离，则应尽可能抽干沉淀，减少其中有机溶剂的含量，如若必要可以装透析袋透析脱有机 溶剂，以免影响样品的生物活性。三、其他沉淀法（一）等电沉淀法：利用蛋白质在等电点时溶解度最低以及不同的蛋白质具有不同等电点一这特性，对蛋 白质进行分离纯化的方法称为等电点沉淀法。在等电点时，蛋白质分子的净电荷为零，消除了分子间的静电斥力，但由于水膜的存在，蛋白质仍有一定 的溶解度而沉淀不完全，所以等电沉淀法经常与盐析法或有机溶剂沉淀法联合使用。单独使用等电点法主 要是用于去除等电点相距较大的杂蛋白。在加酸或加碱调节pH的过程中，要一边搅拌一边慢慢加入，以防 止局部过酸或过碱 。（二）非离子多聚物沉淀法：聚乙二醇（PEG），葡聚糖，右旋糖苷硫酸钠等非离子多聚物可以沉淀蛋白质和细菌。沉淀机理：空间位置排斥效应。试剂溶解度大，在水中占据大部分空间，将需沉淀物相互靠近，增加碰撞 机率。优点：（1）操作条件温和，不易引起变性；（2）具有极高的沉淀效率；（3）沉淀后多聚物容易除去。 应 用：

9、 沉淀分离细菌，病毒蛋白。（三）成盐沉淀法（1）金属离子沉淀法：蛋白质在碱性溶液中带负电荷，能与金属离子形成金属复合盐沉淀。常用的金属 离子 Zn2+ 、Ca2+ 、Pb2 （2）有机酸沉淀法 （3）无机酸沉淀法：磷钨酸、磷钼酸等能与阳离子形式的蛋 白质形成溶解度极低的复合盐，从而使蛋白质沉淀析出 特点：常使蛋白质发生不可逆的沉淀，应用时必须谨慎（四）选择性变性沉淀法：选择一定的条件使溶液中存在的某些杂蛋白变性沉淀而不影响所需蛋白质的方 法称为选择性变性沉淀法。 热变性利用生物大分子对热的稳定性不同，加热升高温度使非目的生物大分子变性沉淀而保留目的物 在溶液中。表面活性剂和有机溶剂变性使那些对表面活性剂和有机溶剂敏感性强的杂蛋白变性沉淀。通 常在冰浴或冷室中进行。选择性酸碱变性 利用对pH值的稳定性不同而使杂蛋白变性沉淀。通常是在分离纯化流程中附带进行 的分离纯化步骤。应用此法，应对欲提纯蛋白质和杂蛋白的理化性质有较全面的了解。第二节 结晶法 结晶是制备纯物质的有效方法。 在生物技术中，结晶主要应用于抗生素、氨基酸、有机酸等小分子的生产中，以作为精制的一种手段。 固体有结晶和无定形两种状态，两者的区别在于它们的构成单位的排列方式不同，前者有规则，后者无规 则。由于只有同类分子或离子才能排列成晶体，故结晶过程有很好的选择性，析出的晶体纯度较高。结晶 是指物质从液态（溶液或熔融体）或蒸气形成晶体的过程,是获得纯净固态物质的重要方法之一。为数众多的 化工产品都是应用结晶方法分离或提纯而得到的晶态物质。以盐和糖为例,世界的年生产能力已超过1亿吨; 化肥如硝酸铵、氯化钾、尿素、磷酸胺等世界的年生产量亦已超过了100万吨;在医药、染料、精细化工生 产中, 虽然结晶态产品产量相对较低,但具有异常重要的地位以及高额的产值。在冶金工业、材料工业中, 结晶亦是关键的单元操作。值得注意的新动向是在高新技术领域中,结晶操作的重要性与日俱增,例如生物 技术中蛋白质的制造,催化剂行业中超细晶体的生产以及新材料工业中超纯物质的净化都离

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