基因工程知识点全
16页1、第一章基因工程概述1. 什么是基因工程,基因工程的基本流程基因工程(Genetic engineering)原称遗传工程。从狭义上讲,基因工程是指将一种或多 种生物体(供体)的基因与载体在体外进行拼接重组,然后转入另一种生物体(受体)内, 使之按照人们的意愿遗传并表达出新的性状。因此,供体、受体和载体称为基因工程的三大1. 分离目的基因2. 限制酶切目的基因与载体3. 目的基因和载体DNA在体外连接4. 将重组DNA分子转入合适的宿主细胞,进行扩增培养5. 选择、筛选含目的基因的克隆6. 培养、观察目的基因的表达第二章基因工程的载体和工具酶1. 基因工程载体必须满足哪些基本条件具有对受体细胞的可转移性或亲和性。具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点。具有多种单一的核酸内切酶识别切割位点。具有合适的筛选标记。分子量小,拷贝数多。具有安全性。2. 质粒载体有什么特征,有哪些主要类型1、自主复制性2、可扩增性3、可转移性4、不相容性主要类型有1.克隆质粒2.测序质粒3.整合质粒4.穿梭质粒5.探针质粒6.表达质粒3. 质粒的构建(1)删除不必要的DNA区域,尽量缩小质粒的分子量,以提高
2、外源DNA片段的装载量。一般来说,大于20Kb的质粒很难导入受体细胞,而且极不稳定。(2)灭活某些质粒的编码基因,如促进质粒在细菌种间转移的mob基因,杜绝重组质粒扩 散污染环境,保证DNA重组实验的安全,同时灭活那些对质粒复制产生负调控效应的基因,提高质粒的拷贝数(3) 加入易于识别的选择标记基因,最好是双重或多重标记,便于检测含有重组质粒的受 体细胞。(4) 在选择性标记基因内引入具有多种限制性内切酶识别及切割位点的DNA序列,即多 克隆接头(Polylinker),便于多种外源基因的重组,同时删除重复的酶切位点,使其单一 化,以便环状质粒分子经酶处理后,只在一处断裂,保证外源基因的准确插入。(5) 根据外源基因克隆的不同要求,分别加装特殊的基因表达调控元件。4. 什么是人工染色体载体将细菌接合因子、酵母或人类染色体上的复制区、分配区、稳定区与质粒组装在一起, 即可构成染色体载体5. 什么是穿梭载体人工构建的、具有两种不同复制起点和选择标记、可以在两种不同的寄主细胞中存活和 复制的载体。6. 入-噬菌体载体及构建-DNA为线状双链DNA分子,长度为,在分子两端各有12个碱基的单链互
3、补粘性末端。1缩短长度提高外源DNA片段的有效装载量删除重复的酶切位点引入单一的多酶切位点接头序列,增加外源DNA片段克隆的可操作性灭活某些与裂解周期有关基因。使入-DNA载体只能在特殊的实验条件下感染裂解宿主细菌,以避免可能出现的污染 现象的发生。加装选择标记,便于重组体的检测单链噬菌体DNA载体过定点诱变技术封闭重复的重要限制性酶切口。引入合适的选择性标记基因,如含有启动子、操作子和半乳糖苷酶氨基端编码序列 (lacZ)的乳糖操纵子片段(lac)、组氨酸操纵子片段(his)以及抗生素抗性基 因等。将人工合成的多克隆位点接头片段插在lacZ标记基因内部,使得含有重组子的噬 菌斑呈白色,而只含有载体DNA的混浊噬菌斑呈蓝色。(4)在多克隆位点接头片段的两侧区域改为统一的DNA测序引物序列,使得重组 DNA分子的单链形式经分离纯化后,可直接进行测序反应。8. II类限制性内切核酸酶的特点限制性核酸内切酶(Restriction endonucleases)是一类能在特异位点上催化双链 DNA分子的断裂,产生相应的限制性片段的核酸水解酶。识别位点的特异性:每种酶都有其特定的DNA识别位点,
4、通常是由4、5或6核苷酸 组成的特定序列(靶序列)。识别序列的对称性:靶序列通常具有双重旋转对称的结构,即双链的核苷酸顺序呈 回文结构。切割位点的规范性:双链DNA被酶切后,分布在两条链上的切割位点旋转对称(可 形成粘性末端或平末端的DNA分子)。同位酶:一部分酶识别相同的序列,但切点不同,这些酶称为同位酶。同裂酶:识别位点与切割位点均相同的不同来源的酶称为同裂酶同尾酶(Isocandamers):识别位点不同,但切出的DNA片段具有相同的末端序列,这些酶 称为同尾酶。9. 甲基化酶II类限制性内切酶有相应甲基化酶伙伴,甲基化酶的识别位点与限制性内切酶相同,并在识 别序列内使某位碱基甲基化,从而封闭该酶切口。甲基化酶在封闭一个限制性内切酶切口的 同时,却产生出另一种酶的切口甲基化酶可修饰限制性核酸内切酶识别序列,从而使DNA免受相应的限制性核酸内 切酶的切割。甲基化酶的用途就是在必要时可以封闭某一限制性核酸内切酶的酶切位点。连接酶连接作用的特点: DNA连接酶需要一条DNA链的3末端有一个游离的羟基(-0H),另一条DNA链的5末 端有一个磷酸基(-P)的情况下,只有在这种情况下,才能
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