TLC与HPLC测定柚皮中柚皮苷和橙皮苷

1、TLC与HPLC测定柚皮中柚皮苷和橙皮苷陈黎1*，冷中成2,* 黄永伦2, (1. 四川农业大学食品学院，四川雅安 625014；2.达州市质检中心，四川达州 635000) 摘要 目的：建立柚皮中柚皮苷、橙皮苷的薄层色谱和高效液相色谱同时测定方法。方法：薄层色谱法以氯仿甲醇丙酮=1131为展开剂，聚酰胺为吸附剂的薄膜立式上行展开；液相色谱法采用Luna C18 (2)柱（4.60 mm150 mm，5 m，100 ）色谱柱；水乙腈（8119）为流动相，以磷酸调pH为2.4；检测波长为283nm；流速为1.0 mL/min；柱温为30 。结果：TLC中柚皮苷和橙皮苷得到分离，Rf分别为0.49和0.69；HPLC中柚皮苷和橙皮苷的分离度大于2.0，理论塔板数均不低于8000，柚皮苷在0.0250.99 g范围内有良好线性关系，r=0.9999；橙皮苷在0.0281.1 g的范围内有良好线性关系，r=0.9999。3个品种柚皮中柚皮苷含量分别是29.90 mg/g、28.39 mg/g和24.56 mg/g，橙皮苷仅在薄层色谱中有检出。结论：本方法可同时测定柚皮中柚皮苷和橙皮苷的含量。关

2、键词 柚皮；柚皮苷；橙皮苷；薄层色谱；高效液相色谱TLC and HPLC Determination of the Contents of Naringin and Hesperidin in pummelo pericarpAbstract Objective: To establish an optimum TLC and HPLC methods to determination of naringin and hesperidin in pummelo pericarp simultaneously. Methods: The chromatogram condition of TLC was follows: the developing agent was chloroform and methanol and acetone (11:3:1), the polyamide was the absorbent and developing with vertical type. Naringin and hesperidin were determined by HPLC

3、 on Luna C18 (2) column (4.60 mm150 mm, 5 m, 100 ) at 30 , the mobile phase was pure water acetonitrile (81:19), adjusted to pH 2.4 with phosphoric acid. The UV detection wavelength was set at 283 nm. The flow rate was 1.0 mL/min. Results: Naringin and hesperidin were separated in TLC by the Rf were 0.49 and 0.69, respectively. The separation was higher than 2.0 between naringin and hesperidin, the column plates both of the naringin and hesperidin were not less than 8000 on the conditions of HPL

4、C; The calibration range of naringin and hesperidin were 0.025-0.99g (r=0.9999) and 0.028-1.1g (r=0.9999), respectively. The contents of naringin of 3 varietal pummelo pericarps were 29.90 mg/g, 28.39 mg/g and 24.56 mg/g, respectively. And hesperidin in 3 varietal pummelo pericarps was only detected by TLC. Conclusions: The method was convenient and accurate of simultaneous determination of naringin and hesperidin contents in pummelo pericarp.Key words Pummelo pericarp; Naringin; Hesperidin; TLC

5、; HPLC 作者简介陈黎（19 ），男，博士，研究方向：药用植物成分分析通讯联系人1：0835-8229290；E-mail：通讯联系人2：0818-2398985；E-mail：柚是芸香科柑桔属Citrus L.植物，又名朱栾、雪柚和气柑等。柚皮中含大量的黄酮类化合物，柚皮苷是主要的黄烷酮，橙皮苷是橙皮素与芸香糖形成的糖苷，为二氢黄酮衍生物。研究表明，柚皮苷及其苷元柚皮素在降血脂、镇静、抗氧化、抗肿瘤、抗动脉粥样硬化等方面具有较强的生物活性1，同时它对原发性骨质疏松症也有良好的防治作用2；橙皮苷具抗脂质氧化、清除氧自由基、抗病毒、抗菌和抗癌等生理功能及延缓衰老等作用3。目前TLC对柚皮苷和橙皮苷的测定多集中在中药中，而对柚皮原料中柚皮苷和橙皮苷的TLC分离未见报道和两成分HPLC同时测定报道较少。因此，本文旨在建立TLC和HPLC同时测定柚皮中柚皮苷和橙皮苷的方法。1. 仪器与试药Shimadzu高效液相色谱仪（SPD-10A VP紫外-可见检测器、LC-6A高压泵、CTO-10AS VP柱温箱含7725i型手动进样器），浙大智达N2000工作站； Sartorius CP225D

6、型电子天平；Millipore Milli-Q型纯水仪；Sartorius BP-20型pH计；Thermo Micromax型离心机；上海亚荣RE-2000型旋转蒸发器；北京中兴伟业ZDHW型调温电热套；重庆贝尔德939型全自动薄层铺板仪；上海精科实业公司WFH-203型三用紫外分析仪；Hamilton公司Syringe微量进样针；Camag公司电动喷雾器。乙腈为色谱纯（Sigma公司）；硅胶G（青岛海洋化工有限公司）；硅胶H（青岛海洋化工有限公司）；聚酰胺薄膜（浙江台州四甲生化塑料厂）；柚皮苷、橙皮苷对照品（Dr. Ehrenstorfer公司），纯度均为(99.00.5)%；其余试剂均为分析纯。2. 材料与方法2.1 材料材料为购于雅安市市场的福建李氏珍珠柚（样品1）、乐山梅家湾柚（样品2）和台湾龙珠蜜柚（样品3），所有材料均由四川农业大学生命科学与理学院植物教研室杨瑞武鉴定为柚。将上述柚的柚皮经100 干燥后，粉碎过60目筛，保存备用。2.2 对照品溶液的制备分别精密称取柚皮苷、橙皮苷对照品，以甲醇-吡啶（91）4定容，配置柚皮苷、橙皮苷浓度分别为24.72 g/mL、28.2

7、4 g/mL的对照品混合溶液及柚皮苷、橙皮苷浓度分别为49.44 g/mL、56.48 g/mL的对照品混合溶液。2.3 供试品溶液的制备2.3.1 TLC 称取样品5.0 g用滤纸包好，置于索氏提取器中，以200 mL的甲醇-吡啶（91）为提取溶剂，提取2 h。待提取液降至室温，通过旋转蒸发器55 浓缩至近干，用提取溶剂洗涤数次，定容至25 mL容量瓶备用。2.3.2 HPLC 精密称取样品0.1 g用滤纸包好，按2.3.1项操作提取3 h，并进行浓缩和定容至25 mL容量瓶。取约2.0mL于离心管中，10000 r/min离心10 min，取上清液进行色谱分析。2.4 方法2.4.1 TLC色谱条件以氯仿甲醇丙酮=1131为展开剂，用微量进样针取柚皮苷、橙皮苷浓度分别为49.44 g/mL、56.48 g/mL的对照品混合溶液0.5 L和样品上清液0.2 L点于聚酰胺薄膜薄层板上，在室温条件下立式上行展开至溶剂前沿离薄层板上沿12 cm，取出，挥干，喷5%三氯化铝无水乙醇溶液，置365 nm紫外光下显色观察，并记录斑点。2.4.2 HPLC色谱条件色谱柱：Luna C18 (2)柱

8、（4.60 mm150 mm，5 m，100 ），由广州菲罗门科学仪器有限公司提供；流动相：水-乙腈（8119）以磷酸调pH=2.4；检测波长为283 nm；流速为1.0 mL/min；柱温为30 ；进样量对照品为10 L,样品为2.5 L；理论塔板数以柚皮苷和橙皮苷的峰计算均不低于8000；柚皮苷与橙皮苷间的分离度大于2.0。柚皮苷和橙皮苷对照品色谱图如图1所示。图1对照品色谱图Fig 1Chromatograms of reference substance1.柚皮苷(naringin)2.橙皮苷(hesperidin)12t/min3.结果与分析3.1 系统适用性实验3.1.1 TLC色谱条件的选择本文考察了多种分离柚皮苷和橙皮苷的展开系统如表1所示。表1 TLC展开系统Table 1 TLC system launched吸附剂展开剂聚酰胺氯仿甲醇丁酮=1221甲醇乙酸水=9055乙醇水吡啶甲醇=8010125氯仿甲醇吡啶=70228乙酸乙酯吡啶水甲醇=809105氯仿甲醇丙酮=1131氯仿甲醇丙酮=1221硅胶H乙酸乙酯吡啶水甲醇=809105乙酸乙酯丁酮甲酸=1062硅胶G

9、乙酸乙酯吡啶水甲醇=809105其中分离效果最好的色谱条件是以氯仿甲醇丙酮=1131为展开剂，聚酰胺为固定相的薄膜立式上行展开，得到柚皮苷和橙皮苷平均迁移率（n=6）分别为0.49和 0.69，可作为样品的分析条件。本文还对醋酸镁溶液和三氯化铝无水乙醇溶液两种不同显色剂对柚皮苷和橙皮苷的显色情况进行对比，发现用三氯化铝无水乙醇溶液效果较好，条带清晰，而且显色条带明显，则本试验采用5%三氯化铝无水乙醇溶液作为显色剂。3.1.2 HPLC色谱柱和流动相的选择本文考察了不同比例（8020、8119和8218）水-乙腈的流动相和不同色谱柱（Gemini C18柱：4.60 mm150 mm，5 m，110 ；Hyperclone BDS C18柱：4.60 mm150 mm，5 m，130 ；Luna C18 (2)柱：4.60 mm150 mm，5 m，100 ）对柚皮苷和橙皮苷色谱分离的影响。在不同色谱柱上，分别取上述比例的水-乙腈作为流动相，并用磷酸调节pH值为2.4，向液相色谱仪注入混合标样10 L，得到在不同色谱柱、三种比例流动相下柚皮苷和橙皮苷的分离度最大的是Luna C18 (2)柱大于1.9；出峰时间适中的是Luna C18 (2)柱分别大于10min和11min；理论塔板数Luna C18 (2)柱为82009200，且流动相水-乙腈比例为8119时三因素的测定值较适中。因此，综合考虑，Luna C18 (2)柱，水-乙腈（8119）作为流动相来进行分析，得到柚皮苷和橙皮苷的分离度为2.3，理论塔板数分别为8900和 8600，

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