祛疣酊渗漉提取工艺研究

1、祛疣酊渗漉提取工艺研究 作者：王芳,高群,谈静,呼梅【摘要】 目的 通过正交试验优选祛疣酊最佳渗漉提取工艺。方法 采用L9(34)正交试验,以丹皮酚和芍药苷含量、浸膏得率为考察指标,优选祛疣酊最佳渗漉提取工艺。结果 正交试验筛选出最佳提取工艺为：加6倍量75%乙醇,浸泡24 h,渗漉速度1 mL/min。结论 优选得到的提取工艺方法简单,药效成分提取率高,成本低。 【关键词】 祛疣酊;提取工艺;正交试验;丹皮酚;芍药苷;浸膏得率Abstract：Objective To optimize the extract technology of Quyou Tincture with orthogonal design. Methods With the determination of peoniflorin and paeonol and the extraction rates as indexes, the extract conditions of Quyou Tincture was optimized by orthogonal design. Results The opti

2、mal preparation process of alcohol was as follows：adding 6 times alcohol (75%), immerse 24 hours and percolate with 1 mL/min. Conclusion The optimum extracting condition was simple, with a high extraction rate and low cost.Key words：Quyou Tincture;percolation extract process;orthogonal design;peoniflorin;paeonol;extraction rate祛疣酊是由牡丹皮、乌梅、山楂等组成的外用中药复方制剂,有清热散结、收敛润燥的功效,临床主要用于治疗扁平疣、尖锐湿疣及毛囊炎等。祛疣酊的提取工艺采用渗漉法,为考察渗漉提取效果,保证制剂质量,本试验以方中主药牡丹皮的主要有效成分芍药苷、丹皮酚的提取量以及浸膏得率作为评价指标,采用正交试验法优选祛疣酊的渗漉提取工艺。1 仪器与试药HP-1100高

3、效液相色谱仪(HP-1100系列二级泵,二极管阵列检测器,HP Chemstation工作站,美国惠普公司);BP211D分析天平(Sartorius公司);AS10200超声波清洗机(天津奥特赛恩斯仪器有限公司)。芍药苷(批号0736-200219)、丹皮酚(批号708-9704)对照品由中国药品生物制品检定所提供。祛疣酊方中各药材由成都中医药大学附属医院药剂科提供。乙腈色谱纯,水为重蒸馏水,其他试剂均为分析纯。2 方法与结果2.1 正交试验优化提取工艺2.1.1 正交设计 查阅相关文献2-3,影响渗漉提取的主要因素是乙醇浓度、用量、渗漉速度和浸泡时间,故选择L9(34)正交表设计正交试验,分别以芍药苷和丹皮酚的含量(每克牡丹皮中芍药苷和丹皮酚的提取量)、浸膏得率为评价指标,正交设计见表1。表1 提取工艺正交设计因素水平表2.1.2 正交试验结果 按祛疣酊处方取各味药材,依照正交试验设计方案进行试验,合并渗漉液,得9份正交试验样品。精密吸取各正交试验样品2 mL,加甲醇稀释至10 mL,混匀,滤过,精密吸取10 ?L,按上述色谱条件测定渗漉液中芍药苷和丹皮酚的含量,并按总体积算出每克

4、原药材中提取成分的量。取正交试验样品1/10体积量,置恒重的蒸发皿中,105 干燥至恒重,放冷,测得干浸膏的量,计算浸膏收得率。将以上测定结果作为评价指标进行综合评分,结果见表2,方差分析见表3。表2 正交试验结果分析表注：采用综合加权评分对试验结果进行分析。浸膏收率评分=(20/最大浸膏收率)浸膏收率;芍药苷含量评分=(40/最大芍药苷含量)芍药苷含量;丹皮酚含量评分=(40/最大丹皮酚含量)丹皮酚含量;综合评分=浸膏收率评分+芍药苷含量评分+丹皮酚含量评分表3 方差分析表注：F0.05(2,2)=19.00,F0.01(2,2)=99.00由试验结果的直观分析及方差分析可知,影响渗漉提取效果的因素顺序为：A>C>D>B,A(乙醇浓度)对渗漉提取效果有显著影响(P<0.05),C(流速)和D(浸泡时间)对提取效果不显著。由直观分析最佳提取工艺为：A2B3C3D1,鉴于B(乙醇用量)因素对提取效果无显著影响,为节约成本,将B3调整为B1,优选提取工艺为A2B1C3D1,即药材加6倍量75%的乙醇,浸泡12 h,渗漉速度1 mL/min。2.1.3 验证试验 按正

5、交试验优选的提取工艺条件A2B1C3D1进行重复性验证试验,结果见表4。从重复性验证试验结果可见,优化条件提取结果芍药苷含量、丹皮酚含量、浸膏收率波动不大,提取液中芍药苷含量的变异系数为3.16%,丹皮酚含量的变异系数为2.88%,干浸膏收率变异系数为0.50%。由此可见,该提取工艺条件是合理、可行的。表4 祛疣酊渗漉提取工艺重复性验证试验结果(n=3)2.2 芍药苷和丹皮酚含量测定12.2.1 色谱条件 色谱柱：Diamonsil ODS-C18(4.6 mm150 mm, 5.0 ?m,依利特公司);以乙腈为流动相A,以0.1%磷酸水溶液为流动相B,按表5进行梯度洗脱;流速1 mL/min,柱温20 ;紫外检测波长230 nm;理论塔板数以芍药苷计不低于2 000,以丹皮酚计不低于5 000。分别按照上述色谱条件测定对照品和初试样品,色谱图见图1。表5 梯度洗脱条件注：A.对照品;B.样品;a.芍药苷;b.丹皮酚图1 袪疣酊HPLC图谱2.2.2 线性关系考察 分别精密称取芍药苷(4.03 mg)、丹皮酚(5.84 mg)对照品,置100 mL量瓶中,加甲醇至刻度,混匀,得芍药苷和

6、丹皮酚对照品溶液。分别精密吸取对照品溶液2、3、5、10、12 ?L和2、5、10、15、20 ?L,注入高效液相色谱仪,依上述色谱条件测定峰面积。以色谱峰面积为纵坐标,以芍药苷、丹皮酚的量为横坐标,进行线性回归。结果表明：芍药苷在0.080 60.483 6 ?g范围内线性关系良好,回归方程为：Y=1 279.331 08X+2.188 78,r=0.999 93;丹皮酚在0.116 81.168 ?g范围内线性关系良好,回归方程为：Y=2 520.113 49X-32.355 70,r=0.999 94。2.2.3 精密度试验 精密吸取对照品溶液10 ?L,照上述色谱条件重复进样6次,记录色谱峰面积。结果芍药苷峰面积平均值为520.578,RSD=0.38%;丹皮酚峰面积平均值为1 443.525, RSD=0.294 3%。2.2.4 重复性试验 精密量取同一初试样品6份,每份2 mL,加甲醇稀释至10 mL,混匀,滤过,精密吸取10 ?L,按上述色谱条件测定,并计算芍药苷与丹皮酚的含量。结果每1 g原药材中提取芍药苷的量平均值为4.786 7 mg,RSD=1.44%;每1 g

7、原药材中提取丹皮酚的量平均值为23.385 2 mg,RSD=1.29%。2.2.5 稳定性试验 取同一初试样品供试品溶液,分别在0、2、5、10、12 h测得芍药苷与丹皮酚峰面积,其峰面积RSD分别为1.35%、0.62%,表明供试品溶液12 h内基本稳定。2.2.6 加样回收率试验 取已知含量的同一初试样品6份,分别精密加入芍药苷对照品溶液、丹皮酚对照品溶液适量,按“2.1.4”项下方法制得供试品溶液,并按上述色谱条件测定溶液中芍药苷与丹皮酚含量,计算加样回收率。结果芍药苷平均回收率为97.64%,RSD=1.32%;丹皮酚平均回收率为99.97%, RSD=0.99%。3 讨论查阅相关文献4-5,芍药苷和丹皮酚的含量测定多选用250 mm的长柱,本试验选择的色谱条件采用C18 150 mm的短柱,同样能对芍药苷和丹皮酚进行很好的分离,测定方法准确可靠,且出峰时间较快。在本试验条件下,当芍药苷的进样量大于0.483 6 ?g(12 ?L)时,色谱峰拖尾明显,标准曲线的相关系数降低,可能与色谱柱的载样量有关,有待进一步的试验研究。根据样品中芍药苷的含量,芍药苷进样量在0.080 60

8、.483 6 ?g间线性关系良好(r=0.999 93),符合样品含量测定的要求。本试验进行正交试验综合评价时,考虑到芍药苷和丹皮酚为该方中主要有效成分,其含量对酊剂疗效影响较大,因此,芍药苷和丹皮酚总含量的权重系数以80%计(各占40%);浸膏收率作为间接参考指标,综合评分时权重系数以20%计。在正交试验条件筛选过程中,以不同的溶媒浓度、溶媒用量、浸泡时间、流速测定了牡丹皮中芍药苷和丹皮酚的提取率。方差分析表明,乙醇浓度为关键因素,流速、浸泡时间、乙醇用量对提取效果不显著。正交试验结果表明,最佳提取工艺为A2B1C3D1,即药材加6倍量75%的乙醇,浸泡12 h,渗漉速度1 mL/min,在此条件下牡丹皮中芍药苷和丹皮酚的提取率稳定且含量较高。【参考文献】 1 国家药典委员会.中华人民共和国药典(一部)S.北京：化学工业出版社,2005.69,119.2 黄建猷,刘智生,黄瑞松.正交实验法优选乳康酊渗漉提取工艺研究J.中国实验方剂学杂志,2007,13(11)：19-20.3 杨 瑜,方世平,肖从新.正交实验法优选赤芍的渗漉提取工艺J.医药导报,2005,24(5)：433-434.4 潘 莹,郭小龙,陈 勇.HPLC法测定杞菊地黄丸中马钱苷、芍药苷和丹皮酚的含量J.中国药科大学学报,2007,38(2)：133-135.5 周 欣,杨文业.高效液相色谱法测定丹栀逍遥丸中栀子苷、芍药苷、丹皮酚和甘草酸含量J.药物分析杂志,2005,25(7)：784-787. / 文档可自由编辑打印

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