细胞生物学实验指导
24页1、细胞生物学实验指导西北农林科技大学生命科学学院细胞生物学教研室 二0九年十月实验一 叶绿体的分离与荧光观察一. 实验 目的 1。 通过植物细胞叶绿体的分离, 了解细胞器分离的一般原理和方法。 2观察叶绿体的自发荧光和次生荧光, 并熟悉荧光显微镜的使用方法. 二. 实 验原 理 将组织匀浆后悬浮在等渗介质中进行差速离心,是分离细胞器的常用方法。叶绿体的分离应在等渗溶液(.35mol/L氯化钠或0。4ml/L蔗糖溶液)中进行, 以免渗透压的改变使叶绿体到损伤。将匀浆液100r/min的条件下离心2in, 以去除其中的组织残渣和未被破碎的完整细胞。然后,在300/的条件下离心5min,即可获得沉淀的叶绿体(混有部分细胞核)。分离过程最好在05的条件下进行,如果在室温下,要迅速分离和观察. 某些物质在一定短波长的光(如紫外光)的照射下吸收光能进入激发态,从激发态回到基态时,就能在极短的时间内放射出比照射光波长更长的光(如可见光),这种光就称为荧光.若停止供能,荧光现象立即停止。有些生物体内的物质受激发光照射后,可直接发出荧光(称为自发荧光),如叶绿素的火红色荧光。有的生物材料本身不发荧光,但它
2、吸收荧光染料后同样也能发出荧光(称为间接荧光),如叶绿体吸附吖啶橙后可发橘红色荧光。本实验利用荧光显微镜对发荧光的叶绿体进行观察。利用荧光显微镜对可发荧光的物质进行检测时,将受到许多因素的影响,如温度,光,淬灭剂等。因此在荧光观察时应抓紧时间, 有必要时立即拍照。另外,在制作荧光显微标本时最好使用无荧光载片、盖片和无荧光油。 三.实验 用 品 1器材: 1)主要设备:普通离心机,粗天平,荧光显微镜;2)小型器材: 剪刀,研钵,移液管,漏斗,滴管, 10m刻度离心管,纱布若干, 无荧光载玻片和盖玻片。2.材料: 新鲜菠菜。 3。试剂: 0.35mol/L氯化钠溶液,0.01%吖啶橙(aridin orange)。 0.1吖啶橙的配制:称取0.1g吖啶橙加蒸馏水10ml做干液,贮棕色瓶,置4冰箱保存。放冰箱备用,临用前取1ml母液加1mo/L磷酸缓冲液(pH48)l稀释。吖啶橙(Aridie Orage,O)是一种荧光色素,其激发滤光片波长8.阻断滤光片波长515n。它与细胞中NA和RN结合量存在差别,可发出不同颜色的荧光(即着色特异性),这是由于NA是个高度聚合物,吸收荧光物质的位置较少
3、,发绿色荧光,而NA聚合度低,能和荧光物质结合的位置多,故发红色荧光.四实 验 方 法 1叶绿体的分离(1)选取新鲜的菠菜嫩叶,洗净擦干后,去除叶梗及粗脉并剪碎,称取2g左右,置于预冷的研钵;(2)加1l的05molL-Na溶液研磨匀浆;(3)用层纱布过滤,滤液盛于烧杯中;(4)取滤液m于1000p离心2m,弃去沉淀;(5)将上清液3000pm离心5in,弃去上清液,沉淀即为叶绿体(混有部分细胞核);(6)沉淀用.3molL-1NaCl溶液悬浮。叶绿体的观察 (1)取叶绿体悬浮液一滴滴于载片上,加盖片后即可在普通光镜和荧光显微镜下观察。(2)在普通光镜下观察,注意观察所分离的叶绿体的形态以及其是否完整。(3)在荧光显微镜下观察叶绿体有无自发荧光,其颜色如何。(4)取叶绿体悬浮液一滴滴在无荧光载片上,再滴加一滴0。01%吖啶橙荧光染料,加无荧光盖片后即可在荧光显微镜下观察其次生荧光。五。注 意 事 项:要得到完整的、有活性的叶绿体,须低温下迅速提取,涂片后立即观察。六.作 业: 描述你所观察到的实验现象,自发荧光和次生荧光的区别?2叶绿体分离的原理是什么?操作过程中应注意什么? 实验二
4、吖啶橙(acrdieoane)染色 观察口腔上皮荧光一目的要求1。熟悉荧光显微镜的原理及使用方法.2观察荧光染料染色后结合物发出的荧光。二实验原理吖啶橙荧光染料可与细胞内DA和RNA结合。其吸收光谱405,发射的荧光光谱是5340nm,因此,吖啶橙和不同的细胞成分结合后,可发射红橙黄绿蓝各色荧光.三.实验用品1.器材:荧光显徽镜、载玻片、盖玻片、染色缸、牙签;.材料:口腔黏膜上皮细胞临时制片;3试剂:1)0.1mol/LH70 PS液。A液:N2POH20 26加蒸馏水至00l;B液,Na2HPO47H205.36g加蒸馏水至100ml;取A液16.5m、B液33.5m、NaCl 8.5g用蒸馏水稀释至100m。2)0.1吖啶橙原液:0.g吖啶橙加蒸馏水至0ml。临用时配制.01吖啶橙染液:将。1吖啶橙原液用P7。PS液稀释.3)95%乙醇四。方法与步骤1用牙签刮取口腔上皮细胞涂在干净载玻片上;。95乙醇溶液固定5in;3滴加01%吖啶橙染液染色5n;4。用PBS缓冲液缓慢冲洗;5.加盖玻片镜检。五.观察结果:描述你所观察到的实验现象,并绘图,表明荧光的颜色。实验三PA(Perodic
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