高通量测序在生殖医学中的应用 高媛 山东大学附属生殖医院

高通量测序在生殖医学中的应用高媛国家辅助生殖与优生工程技术研究中心山东大学附属生殖医院生殖与遗传的影响会贯穿人的一生遗传病诊断病史临床体格检查、一般辅助检查遗传病因的明确（NGS应用领域）GeneticTesting植入前遗传学检测（NGS在生殖医学的主要应用）NeonatalScreening染色体检测（植入前遗传学筛查）分子检测，例如突变的检测CarrierTesting产前诊断与筛查PrenatalDiagnosis胎儿影像学检测等有创产前诊断无创产前检测（NGS应用领域）Preimplantation GeneticDiagnosis/Screening新生儿筛查（NGS应用领域）孕前携带者筛查（NGS应用领域）Image from McGraw-Hill Companies,Inc.主要内容胚胎植入前遗传学检测（PGT）高通量测序与PGT技术的发展PGT的质量控制PGT的现存问题主要内容胚胎植入前遗传学检测（PGT）高通量测序与PGT技术的发展PGT的质量控制PGT的现存问题辅助生殖与胚胎植入前遗传学检测收集生殖细胞体外受精受精卵分裂植入卵细胞第一代精子第二代（ICSI)健康胚胎ICSI第三代(PGD)检测受体妈妈的卵细胞供体妈妈的卵细胞体外受精受体的受精卵PGD线粒体基因检测供体的受精卵（精子为同一来源）第四代胚胎植入前遗传学检测的背景1.大多数的遗传性疾病目前还缺乏有效的治疗手段。2.对患病胎儿进行选择性流产/引产给孕妇造成身心的双重伤害；3.预防遗传性疾病的再次发生。胚胎植入前遗传学检测的定义胚胎植入前遗传学检测（Preimplantation Genetic Testing,PGT）包括胚胎植入前遗传学诊断（Preimplantation GeneticDiagnosis,PGD）与胚胎植入前遗传学筛查（PreimplantationGenetic Screening,PGS）。胚胎植入前遗传学诊断胚胎植入前遗传学诊断（Preimplantation Genetic Diagnosis,PGD）是指在体外受精过程中，对具有遗传风险患者的胚胎进行植入前活检和遗传学分析，以选择无遗传学疾病的胚胎植入宫腔，从而获得正常胎儿的诊断方法。这种方法可有效地防止遗传性疾病患儿的出生，是产前诊断的延伸，是遗传学诊断的又一充满希望的新技术。PGD绒毛采集羊水采集脐血采集胚胎植入前遗传学筛查胚胎植入前遗传学筛查（preimplantation genetic screening，PGS）是对早期胚胎进行染色体数目和结构异常的检测，筛查出正常染色体的胚胎植入，从而提高植入的成功率。美国Natera公司，5年46,439例PGS样本，6,365 个周期。其中进行囊胚期PGS检测的患者分布PGS临床指征 35岁以上妇女 3次优质胚胎移植着床失败 多次胚胎移植总移植胚胎数10次着床失败 3次反复自然流产PGT的适应证ESHRE数据显示51589个PGD周期所对应的适应征指征周期数11,08430,033比例21%58%单基因遗传病非整倍体筛查染色体疾病810416%性别选择-X连锁疾病性别选择-社会因素16037653%2%J Clin Med.2014;3(1):280309.全球137个IVF中心所做PGD对应的适应征Percent of Clinics Offering ThisIndication for PGDTyp e of PGDAneuploidy testing93%Single gene disorders82%67%Structural chromosomerearrangementsFetal sex for X-linked diseaseNon-medical sex selection58%42%28%24%6%Avoid adult onset disorderHLA typing with disease testingHLA typing without disease testingSelection for a disability3%*HLA=human leukocyte antigen.J Clin Med.2014;3(1):280309.胚胎植入前遗传学诊断/筛查技术专家共识中华医学遗传学杂志，2018年第2期胚胎植入前遗传学诊断/筛查技术专家共识适应证和禁忌证-适应证女方高龄：38岁及以上；不明原因反复自然流产：反复自然流产2次；PGS不明原因反复种植失败：移植3次及以上或移植高评分卵裂期胚胎数4-6个或高评分囊胚数3个及以上均失败的；严重畸精子症。染色体异常：夫妇任一方或双方携带染色体结构异常，包括相互易位、罗氏易位、倒位、复杂易位、致病性微缺失或微重复等；单基因遗传病：致病基因突变诊断明确或致病基因连锁标记明确具有遗传易感性的严重疾病：夫妇任一方或双方携带有严重疾病的遗传易感基因的致病突变PGD人类白细胞抗原（HLA）配型胚胎植入前遗传学诊断/筛查技术专家共识适应证和禁忌证-PGD禁忌症目前基因诊断或基因定位不明的遗传性疾病；非疾病性状的选择：如性别，身高，容貌，肤色等；其它不适宜实施PGD的情况。胚胎植入前遗传学诊断/筛查技术专家共识适应证和禁忌证-其他几种特殊情况性染色体数目异常：如47，XYY、47，XXX等不建议PGD；47，XXY生育染色体异常后代风险增加，可酌情考虑PGD；常见的染色体多态：如1qh+、9qh+、inv(9)(p12q13)、Yqh+等不建议PGD。PGT临床流程Array CGHSanger SequencingFISHNext Generation SequencingTur-Kaspa,I.et al.(2014)Preimplantation genetic diagnosis for inherited neurological disordersNat.Rev.Neurol.doi:10.1038/nrneurol.2014.84胚胎植入前遗传学检测（PGT）的关键 如何安全地获得有效胚胎遗传性样本显微操作取样 如何准确及时地完成遗传性样本的筛查/诊断单个/3-5个细胞的检测，短促的时间窗PGD各步骤的时间控制Jiang B,et al.,Best Pract Res Clin Obstet Gynaecol.2012;26(5):551-9.主要内容胚胎植入前遗传学检测（PGT）高通量测序与PGT技术的发展PGT的质量控制PGT的现存问题PGT相关技术Next Generation SequencingArray CGHSanger SequencingFISHMultiplex PCR问题:传统的基于PCR的PGD可以帮助一对夫妇获得没有特定单基因遗传疾病的孩子，但是极少量的胚胎样本难以满足同时进行染色体异常筛查的需要。如果一个女性超过了35岁，我们该做什么，怎么做？高通量测序技术的应用在检测单基因致病靶基因的同时，可完成染色体水平的检测，减少非整倍体、染色体易位、片段缺失或重复带来的染色体异常全基因组扩增产物可同时满足PGS和单体型分型（PGD）DOP-PCR（简并寡核苷酸引物PCR）MALBAC（多次退火环状循环扩增技术）MDA（多重置换扩增技术）Annu.Rev.Genomics Hum.Genet.2015;16:79102单细胞扩增技术ADO:allele dropoutCR:chimera rateCV:coefficient of variationFPR:false positive rateUMR:unmappable rateWGA:whole genome amplificationAnnu.Rev.Genomics Hum.Genet.2015;16:79102单细胞扩增技术DOP-PCR(Sureplex)-MALBAC-MDA(REPLI-g)方法比较三种不同WGA方法扩增产物琼脂糖凝胶电泳图三种不同WGA方法扩增产物进行拷贝数变异检测（CNV）对比图DOP-PCR 和MALBAC 方法在拷贝数变异（CNV）检测上优于MDA 方法。MALBAC方法对GC含量高的序列有扩增偏好，但通过生物信息学方法矫正后也可准确地分析拷贝数变异（CNV），对于GC含量较高的物种可以选择该种方法。MDA方法操作简单，扩增随机，对GC含量没有偏好性，在SNP的研究中具有优势，特别是在样本量较少的情况下。The Performance of Whole Genome Amplification Methods and Next-Generation Sequencing for Pre-Implantation Genetic Diagnosis ofChromosomal Abnormalities.Na Li,Li Wang,et al.J Genet Genomics.2015 Apr 20;42(4):151-9.doi:10.1016/j.jgg.2015.03.001.Epub 2015 Mar14.Quantitative assessment of single-cell whole genome amplification methods for detecting copy number variation using hippocampalneurons.Ning L,Li Z,et al.Sci Rep.2015 Jun 19;5:11415.doi:10.1038/srep11415.WGA技术进展单细胞WGA新技术“LIANTI”利用更为均一的线性扩增，提高单细胞CNVs检测的分辨率（from 1Mb to 10kb），降低单细胞SNVs检测的假阳性率Chen et al,Science,2017高通量测序SNP分型确定单体型的技术原理父亲母亲先证者CACTGGCCTTAACATCGG基因型母亲父亲父亲母亲先证者正常患者CTCATTCACCAT携带者携带者单体型GGACGG患者先证者高通量测序在PGD中的应用：病例：脊肌萎缩症家系 脊肌萎缩症是一种影响肌肉运动控制的遗传性疾病，由于运动神经元的损伤，导致控制爬、走、站立和头部运动的肌肉萎缩。I12 脊肌萎缩症在人群中发病率约1/6000到1/10000，在汉族人群中的携带率约1/40到1/60。II21 脊肌萎缩症由SMN1基因的异常或缺失引起，SMN1基因编码一种对运动神经元很重要的蛋白。大约95%的脊肌萎缩症病人均是由于SMN1基因外显子7的纯合缺失引起。家系病历I1和I2夫妇曾经有一个患脊肌萎缩症的女儿，3个月时夭折。I2在2013年再次怀孕，产前诊断发现又是脊肌萎缩症患儿，该夫妇进行了选择性流产。该夫妇很渴望生一个健康的孩子，前来我中心咨询。高通量测序在PGD中的应用：病例：脊肌萎缩症家系PGD前的致病突变确认及家系连锁分析SMN1基因外显子7和8杂合缺失SMN1基因外显子7和8杂合缺失SMN1-STR1SMN1-STR2SMN1-STR3SMN1-STR4SMN1-STR5SMN1SMN1-STR6SMN1-STR7SMN1-STR8SMN1-STR9SMN1-STR10SMN1-STR11186 186186 182176 170142 140166 166146 146NMNM186 182110 110110 116170 166140 146221 225112 104223 215112 112MM110 116SMN1基因外显子7和8纯合缺失SMN1基因外显子7和8纯合缺失SMN1-STR12 188 180176 176225 215104 112180 176高通量测序在PGD中的应用：病例：脊肌萎缩症家系传统STR的连锁分析用于脊肌萎缩症PGD（对照）E1E3E8E11E13E18E21胚胎编号182 186166 176146 142186 186176 166142 146186 186176 166142