NO38基因工程讲义教材.ppt

复习检查：1.基因工程概念？原理？2.基因工程操作的基本工具有哪些？3.限制性核酸内切酶的来源？特性？作用部位？结果？4.DNA连接酶的分类？作用？连接部位？5.DNA连接酶与DNA聚合酶的区别？6.常用的运载体有哪些？作为运载体必须具备的条件?7.基因工程的操作步骤？核心？8.基因文库？基因组文库？部分基因文库？cDNA？9.PCR技术扩增目的基因的原理？条件？前提？过程？10.基因表达载体构建的目的？基因表达载体的组成？11.目的基因导入植物细胞的方法?最常用方法及原理?12导入动物细胞的方法?受体细胞是?导入微生物的方法?13.基因工程从分子水平检测可分别检测哪些对象?如何检测?从个体水平如何鉴定?考点一：基因工程的基本工具线性【典例1】 已知某种限制性内切酶在一线性DNA分子上有3个酶切位点，如图中箭头所指，如果该线性DNA分子在3个酶切位点上都被该酶切断，则会产生a、b、c、d四种不同长度的DNA片段现在多个上述线性DNA分子，若在每个DNA分子上至少有1个酶切位点被该酶切断，则从理论上讲，经该酶切后，这些线性DNA分子最多能产生长度不同的DNA片段种类数是（ ）A3 B4 C9 D12【典例2】镰刀型细胞贫血症的病因是血红蛋白基因碱基序列发生了改变。

检测这种碱基序列改变必须使用的酶是 （ ）A解旋酶B.DNA连接酶C.限制性内切酶D.DNA聚合酶 【典例3】下列有关基因工程中限制内切酶的描术，错误的是（）A. 一种限制性内切酶只能识别一种特定的脱氧核苷酸序列B. 限制性内切酶的活性受温度的影响C. 限制性内切酶能别和切割RNA D、限制性内切酶可从原核生物中提取线性DNA分子的酶切示意图【归纳点拨】1、要想获得某个特定性状的基因必须要用限制酶切几个切口？可产生几个黏性末端？2、如果把两种来源不同的DNA用同一种限制酶来切割，会怎样呢？3、大多数限制酶识别的序列由几个核苷酸组成？4、平末端是从识别序列的什么部位切开？5、Ecoli DNA连接酶 T4 DNA连接酶在缝合的时候有什么不同？6、DNA连接酶和DNA聚合酶是一回事吗？7、DNA水解酶和DNA解旋酶的作用和上面两种酶有什么不同？8、质粒有哪些特点？2个， 4个产生相同的黏性末端绝大多数6个，少数为4、5、8个中心轴线Ecoli DNA连接酶连接黏性末端 ； T4 DNA连接酶连接黏性末端 和平末端不是DNA水解酶水解磷酸二酯键将DNA分子水解为游离的脱氧核苷酸；DNA解旋酶破坏DNA的氢键，使其变为单链结构。

能自我复制 有一个到多个限制酶识别位点 具有标志基因考点二：基因工程的基本步骤【典例3】为扩大可耕地面积，增加粮食产量，黄河三角洲等盐碱地的开发利用备受关注我国科学家应用耐盐基因培育出了耐盐水稻新品系1）获得耐盐基因后，构建重组DNA分子所用的限制性内切酶作用于图中的 处，DNA连接酶作用于 处填“a”或“b”）（2） 将重组DNA分子导入水稻受体细胞的常用方法有农杆菌转化法和 法3）由导入目的基因的水稻细胞培养成植株需要利用 技术该技术的核心是 和 4）为了确定耐盐转基因水稻是否培育成功，既要用放射性同位素标记的 作探针进行分子杂交检测，又要用 方法从个体水平鉴定水稻植株的耐盐性 aa基因枪脱分化 再分化目的基因一定浓度盐水浇灌植物组织培养技术【归纳点拨】（一）目的基因的获取1.从基因文库中获取基因文库的构建方法（动手写出构建流程）1）直接分离法： 2）反转录法：某生物体中全部DNA 限制酶许多DNA片段 与运载体连接 导入受体菌群从中直接分离目的基因的mRNA 反转录单链DNA片段 合成双链DNA 与运载体连接 导入 受体菌群2.利用PCR技术扩增目的基因：（1）PCR技术概念：PCR全称为_，是一项 在生物_复制_ 的核酸合成技术 原理：_（2）条件：_、_、_ _ 、 _.前提条件： _. （3）扩增过程：a变性（ ）：目的基因DNA受热变性后接连为单链b退火（ ）： 与单链相应互补序列结合c延伸（ ）：在 的作用下进行延伸Taq酶的特点是 。

聚合酶链式反应体外 特定DNA片段DNA双链复制原理原料：四种脱氧核苷酸 模板酶：热稳定的DNA聚合酶 能量引物90955560 引物7075 热稳定DNA聚合酶热稳定PCR技术与DNA复制的比较：3.人工合成当基因较小，核苷酸序列已知时，可以用人工方法合成（例如，通过 直接合成）PCR技术DNA复制相同点原理原料条件不同点解旋方式场所酶结果DNA双链复制四种脱氧核苷酸原料、模板、酶、能量加热 解旋酶体外 细胞内Taq酶 解旋酶、DNA聚合酶目的基因扩增 DNA数目加倍DNA合成仪蛋白质的氨基酸序列蛋白质的氨基酸序列mRNAmRNA的核苷酸序列的核苷酸序列结构基因的核苷酸序列结构基因的核苷酸序列目的基因目的基因推测推测推测推测化学合成化学合成人工合成法人工合成法: :根据已知的氨基酸序列合成根据已知的氨基酸序列合成DNADNA法法 ：（二）基因表达载体的构建（核心）1.过程：用一定的_切割 质粒，使其出现一个切口，露出_用_切断目 的基因，使其产生_将切下的目的基因片段插入质粒的_处， 再加入适量_，形成了一个重组 DNA分子（重组质粒）基因表达载体的组成：复制原点+ + 思考：1、绘一个基因表达载体示意图： 2、构建表达载体的目的是什么？限制酶黏性末端同一种限制酶相同黏性末端切口DNA连接酶启动子 目的基因终止子 标记基因使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代。

三）将目的基因导入受体细胞1.将目的基因导入植物细胞（1）农杆菌转化法：转化：目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程，称为农杆菌特点：在自然条件下能感染植物和 植物，对 植物没有感染力；Ti质粒的 可以转移至受体细胞，并整合到受体细胞的上2）基因枪法又叫3）花粉管通道法：利用花粉管通道使目的基因进入，然后进入2、将目的基因导入动物细胞（1）方法：2）操作程序：目的基因的提纯取卵（受精卵） 移植子宫内发育新性状动物3、将目的基因导入微生物细胞（1）原核生物的特点：2）常用的受体细胞：3）转化：处理细胞 细胞表达载体与感受态细胞混合感受态细胞吸收分子，完成转化转化双子叶 裸子绝大多数单子叶T-DNA微弹轰击法花粉管受体细胞显微注射技术表达载体采用显微注射仪进行显微注射繁殖快、多为单细胞、一遗传物质相对较少Ca2+感受态DNA染色体DNA 目的基因插入Ti质粒的T-DNA上 农杆菌 导入植物细胞 整合到受体细胞的染色体上 目的基因的遗传特性得以维持稳定和表达农杆菌特点：易感染双子叶植物和裸子植物Ti质粒的T-DNA可转移至受体细胞的染色体上2.转化（四）目的基因的检测与测定1）检测转基因生物的 上是否插入了目的基因检测方法： 技术，即将转基因生物的基因组DNA提取出来，在含有目的基因的DNA片段上用放射性同位素等作标记，以此作为 ，使探针与基因组DNA杂交，如果出现 ，就表明目的基因已插入染色体DNA中。

2）检测目的基因是否 ：检测方法： 技术（3）检测目的基因是否 ，检测方法： ，从转基因生物中提取蛋白质，用相应的抗体进行检测，若有 出现，表明目的基因已形成蛋白质产品4）进行 水平的鉴定染色体DNADNA分子杂交探针杂交带转录出mRNA分子杂交翻译成蛋白质抗原抗体杂交杂交带个体 不能，还必须检测目的基因翻译出蛋白质不能，还必须检测目的基因翻译出蛋白质（或受体细胞表现出特定的性状），才能（或受体细胞表现出特定的性状），才能说明目的基因完成了表达说明目的基因完成了表达受体细胞摄入受体细胞摄入DNADNA分子后就说明目的基因完分子后就说明目的基因完成了表达吗？成了表达吗？3.下表关于基因工程中有关基因操作的名词词及对应对应 的内容，正确的组组合是4、下列属于获取目的基因的方法的是( )利用mRNA反转录形成从基因组文库中提取从受体细胞中提取 利用PCR技术 利用DNA转录 人工合成A. B. C. D.5.细菌的质粒分子带有一个抗菌素抗性基因，该抗性基因在基因工程中的主要作用是 A提高受体细胞在自然环境中的耐药性 B有利于对目的基因是否导入进行检测C增加质粒分子的分子量D便于与外源基因连接6. 有关基因工程的叙述正确的是A限制酶只在获得目的基因时才用B重组质粒的形成是在细胞内完成的C质粒都可作为运载体 D蛋白质的结构可为合成目的基因提供资料7.7.哪项不是基因表达载体的组成部分哪项不是基因表达载体的组成部分( )( ) A. A.启动子启动子 B. B.终止密码终止密码 C. C.标记基因标记基因 D. D.目的基因目的基因8.8.下列哪项不是将目的基因导入植物细胞的方法下列哪项不是将目的基因导入植物细胞的方法( )( ) A A基因枪法基因枪法 B B显微注射法显微注射法 C. C.农杆菌转化法农杆菌转化法 D D花粉管通道法花粉管通道法1.下列关于基因工程的叙述，错误的是（ ）A目的基因和受体细胞均可来自动、植物或微生物B限制性核酸内切酶和DNA连接酶是两类常用的工具酶C人胰岛素原基因在大肠杆菌中表达的胰岛素原无生物活性D载体上的抗性基因有利于筛选含重组DNA的细胞和促进目的基因的表达3.DNA测序工作中，需要将某些限制性内切酶的限制位点在DNA上定位，使其成为DNA分子中的物理参照点。

这项工作叫做“限制酶图谱的构建”假设有以下一项实验：用限制酶Hind，BamH I和二者的混合物分别降解一个4kb(1kb即1千个碱基对)大小的线性DNA分子，降解产物分别进行凝胶电泳，在电场的作用下，降解产物分开，如下图所示：据此分析，这两种限制性内切酶在该DNA分子上的限制位点数目是以下哪一组?A、Hindl个，BamHI 2个 B、Hind2个，BamHI 3个 C、Hind2个，BamHI 1个 D、HindIII和BamHI各有2个4.一长度为1000碱基对(bp)的DNA分子，用限制性核酸内切酶Eco R1酶切后得到的DNA分子仍是1000 bp，用Kpnl单独酶切得到400 bp和600 bp两种长度的DNA分子，用EcoRl、Kpnl同时酶切后得到200bp和600bp两种长度的DNA分子该DNA分子的酶切图谱正确的是：（ ） 5.基因工程中，需用特定的限制酶切割目的基因和质粒，便于重组和筛选已知限制酶I的识别序列和切点是GGATCC一，限制酶II的识别序列和切点是一GATC一根据图示,判断下列操作正确的是： A质粒用限制酶I切割，目的基因用限制酶II切割B质粒用限制酶II切割，目的基因用限制酶I切割C目的基因和质粒均用限制酶I切割 D目的基因和质粒均用限制酶II切割。