高产谷胱甘肽酵母菌株的选育和培养条件的初探（ X页）.doc

高产谷胱甘肽酵母菌株的选育和培养条件的初探摘 要：以Saccharomyces cerevisiaeGJ96-2为岀发菌株，通过紫外线照射结合乙硫氨酸平板筛 选，连续两代诱变筛选分离得到高产突变株Saccharomyces cerevisiae SE-2：摇瓶试验胞内谷胱 廿肽含量达到2.2%,较出发菌株G796・2提岛62.9%,传代试验表明其遗传性能稳定对SE・2的 培养条件进行了研究采丿I］正交化实验和双碳源实验对培养基进行优化，结果表明，最佳初糖 浓度6%,葡萄糖/糖蜜=3.5:1,半胱氨酸的添加浓度5mmoL L-1较为适宜在优化的培养条件 下培养39h, SE-2谷胱肽总量达180mg L-l以上 较G796-2提高8L2%1前言谷胱廿肽，Y厶谷氨酰厶半谷氨酰■廿氨酸(Y -L-glutamyl-L-cystcinyl-glycinc,简称GSH)是一种 广泛存在于动植物和微生物细胞中具有多种生理功能的三肽［1］发酵法生产GSH就是选育(或 构建)GSH合成能力强和胞内含量高的微生物、筛选和优化培养基配方、建立和优化发酵控制策 略、改进和捉高下游过程技术等，最终提高GSH的产率和质量［2］。

Sakato等［3］采用先进的 YEWPACKINSTRMENTATION SYSTEM控制系统发酵介成GSH林建平等［4］利用啤酒废酵母 合成GSH采用发酵法生产GSH的关键，是获得性能优良的高产菌株本课题组选用产GSH酵 母菌株，经过两代紫外线诱变，乙硫氨酸耐性平板筛选，得到GSH含暈更高的突变株，并对该 突变株的培养条件进行研究2材料与方法2.1实验材料2.1.1菌种 酿酒酵^(Saccharomyces cerevisiae)^株，本实验室保存菌株2.1.2培养基：1) 斜而与平板培养M(g L-)：麦芽汁10；酵母粉3；蛋白月东5；葡萄糖10：琼脂202) 摇瓶筛选培养基(g L"1)：葡萄糖30；酵母粉6； (NH4)2HPO4 3： K2HPO4 1: KH2PO41； MgSO40.8： CYS 0.2； ATP 0.23) 摇瓶发酵培养基(g LH)：葡萄糖60；酵母粉 12； (NH4)2HPO46； MgSO4 4.8： K2HPO4 1: KH2PO4 1： FeSO4 0.008； MnSO4 0.008； ZnSO4 0.008：玉米浆 24；糖蜜 17：麦汁30。

2.2实验方法2.2.1培养和分析方法从活化斜面上挑取一环菌体接入摇瓶筛选培养基，装量为50mL/250mL二角瓶，置摇床170r- min】，30C培养39h而发酵培养则是将24h种子液以10%的接种量，接入发酵培养慕，装量 50mL/250mL三角瓶，置摇床170 r-min1, 3(TC培养24hGSH含量测定方法:四氧喀睫法⑸ 2.2.2诱变和筛选方法从活化斜面上挑取一环菌体接入液体培养基，置摇床170 r min *, 3(TC培养16h, 4000 r min 1 离心收集菌体，以0.85%生理盐水洗涤，稀释制得IO?个细胞mL】菌悬液取5mL菌悬液置于 肓径9cm无菌平皿中，用紫外灯(功率15W,距离30cm)照射180s,将照射后菌液用0.85%生理盐 水稀释10倍，吸取0.2mL涂布含0.3%氯化锂，lOOpgmL-1乙硫氨酸筛选平板30C培养4〜6 天，挑选菌落进行筛选第二代诱变就是将第一代诱变筛选出的高产菌株作为出发菌株，如上 述条件培养，诱变，稀释，吸取0.2mL涂布含0.3%氯化锂，300gg mL-1乙硫氨酸筛选平板 30C培养4〜6夭，挑选菌落进行筛选从筛选平板上挑取一定数量的抗性突变株至斜面培养基，培养2〜3天后将菌株接入摇瓶筛选培 养基，培养39h后测定GSH含暈。

挑取GSH含暈提高的高产菌株进行复筛复筛就是将初筛 的较好的菌种，按每株3瓶，培养39小时后测GSH胞内含量，确定高产菌株3结果与讨论3.1菌种诱变筛选将待筛选的8株酵母菌接入摇瓶培养基培养，其中G796-2的胞内含暈最高，为1.35%,产暈达 39陀丄匕 作为诱变的岀发菌株对G796-2菌株进行紫外诱变后，涂布筛选平板，初筛得到 高产突变株共17株，然后对这17株进行复筛，测定GSH含量，结果见表1 表1第一代诱变高产突变株复筛Table 1 Rescieening of GSH-high-yielding mutant in the first generationNumber of strainGSH/mg-L"1GSH/%Number of strainGSH/mg-L1GSH / %G796-239.161.50135BU-945.262.401.57BU-145.23 2.201.55BU-1053 841.201 40BU-250.561.701.68BU-1156.36 + 2.201.54BU-341.72l,801.39BU-1255・762・301 68BU-449.301.601.43BU-1340.25 + 1.901.36BU-54&95 2.001.50BU-1460.001.801.80BU-642.342・10137BU-1552・371.601 66BU-740.48 + 1.90135BU-1655.64 + 2.001.78BU-848 21 2.301.55BU-1752.28 士 1.501.55从表1看出，BU-14突变株GSH含量达到1.8%, W以作为进一步诱变的出发菌株。

对BU・14进 行第二代诱变，涂布筛选平板，初筛得到高产突变株共8株，然后对这8株进行复筛，测定GSH 含量，结果见表2=.从表2看出，SE-2含量达2.2%同时对SE・2突变株和其它产GSH菌株在 胞内含量和筛选方法进行了比较，结果见表3以酿酒酵母5. cerevisiae G796-2作为出发菌株, 用紫外线诱变和乙硫氨酸耐性平板筛选方法，得到SE・2突变株，GSH含量提高62.9%将突变 株SE・2在斜面培养基连续传8代，每传2代用摇瓶筛选培养基测定GSH含量，结果见表4从 表4可以看出，突变株SE・2的GSH平均产量达80 mg-L-1,胞内含量2.1%以上，菌株产GSH能 力稳定表2第二代诱变高产突变株复筛Tnble 2 Rescreening of GSH high-yielding mumnt in the second generationNuiubei of strainGSH, mg・L“GSH / %Number of strainGSH / mg-L1GSH / %SE・166851 802.0SE・575・862.l02.10SE-27S.302.002.2SE・668.64 1.501.92SE-358.452.101 84SE-765.20l 901.88SE-475 642・302.0SE-870.12I 802.10表3 GSH生产菌株的比较Table 3 Compm isou of GSH pi oduding muziHMethodStrainMutantStrain GSH %Mutant GSH’％Growth percent.-%uv+desw】S. cere\ isiae S-12S・ co^isiae M-050.861.462.8W+uthiomg 丨C.urihs CC.uhlis C U B-100 7310370UV7+ethionine*31Candida sp K】】Candida KnUE1261.802.433.3U\T+LiCl+ethionineS. cerev isiae G796-2S・ cerevisiae SE-21.352.262.9表4 SE-2稳定性实验Table 4 Stability experiment of SE-2 mutantNumber of generationGSH /mg L-1GSH / %Number of generationGSH / mg L1GSH.%280.562.2683.452.1485.267 ?878.792.13.2 SE-2高产突变株摇瓶培养条件的初探3.2.1正交优化实验首先研究不同浓度的初糖对GSH产量的影响。

初糖浓度分别为3%, 6%, 9%, GSH产量分别 为55.6mg LT, 69.6 mg L1, 41.1 mg LHo SE-2高产突变株培养最佳初糖浓度为6%为了进 一步优化摇瓶发酵培养基，又另添加糖蜜、玉米浆、麦汁和适量的微量元索以玉米浆(16, 24, 32g •Lj、MgSO4(3.6,4.& 6.0g L/)、糖蜜(15, 30, 45g・ L)和麦汁(30, 60, 90/g L/)按照L9(34) 4 个 因素3水平正交实验，共9组配方进行摇瓶培养实验，结果见表5根据4个I大1索极差分析， RA>RD>RC>RB，糖蜜是较重要的因素，玉米浆是较次要的因素第一列因索K\>K3>K2 (89.91 >84.21 >82.29)；笫二列因索K2>K1>K3 (87.06>85.28>84.47)：第三列因索K2>K3> K1 (8&40>84.87>83.51),第四列因素KI>K2>K3 (89.19>85.99>81.63)所以确定最佳实验 条件为:A1B2C2DU表5 正交优化实验数据处理Table 5Calculatlou of data of orthogonal experimentNumber of tc^tA: Molasses / g-L~l B:Corn syrup / g-L 1CiMgSO^/gL1D: Malt extract / g-L*GSH/mgL11111191.0S2I22294 583133384.0742123SO 825223186.616231279.467313283 95S3213S0.009332189.90后89 91S5.2883.5189.1982.2987.0688.4085.9984 61S4.4784.87SI.63R7 622.594 897 563.2.2双碳源优化实验从正交实验得到最佳培养MA1B2C2D1,其中的碳源有葡萄糖、糖蜜。

这两种碳源中,葡萄糖对 发酵影响较人，而糖蜜是正交实验中最重要的因索所以有必要对这两碳源进一步优化，对糖 蜜和葡萄糖这两种碳源重新按质量分配比例，对A1B2C2D1培养基作进一步改进设计以下5 组不同的培养基,葡萄糖/糖蜜质量比分别为4:1, 3.5:1, 3:1, 2.5:1, 2:1,进行摇瓶实验。