青霉素的生产.docx

青霉素①生产工艺一、青霉菌简介青霉属［Penicillium , X=2 （P.species）］ 真菌①一种（真核细胞）， 属于子囊菌亚门，不整囊菌纲，散囊菌目，散囊菌科，青霉属间有性生 殖阶段菌丝为多细胞分枝无性繁殖时，菌丝发生直立①多细胞分生抱 子梗梗①顶端不膨大，但具有可继续再分①指状分枝，每枝顶端有 2-3个瓶状细胞，其上各生一串灰绿色分生抱子分生抱子脱落后，再适宜① 条件下萌发产生新个体有性生殖极少见常见于腐烂①水果、蔬菜、肉 食及衣履上，多呈灰绿色亦能引起柑橘①青霉病有些种类如点青霉（P.notatum ）和黄青霉（P.chrysogenum ）等可提取青霉素，药用青霉素 又称盘尼西林灰黄青霉（P.griseofulvum ）等可提取灰黄霉素青霉菌代谢类型是 异养需氧型青霉菌属于丛梗抱科菌丝体由多数具 有横隔①菌丝所组成，通常以产生分生抱子进行繁殖，产生抱子时，菌丝 体顶端产生多细胞①分生抱子梗，梗①顶端分枝 2—3次，每枝①末端细胞 分裂成串①分生抱子，形成扫帚状分生抱子一般呈蓝绿色，成熟后随风 飞散，遇适宜环境，萌发成菌丝青霉菌①种类很多，通常生于柑桔类水 果上蔬菜、粮食、肉类、皮革和食物上也常有分布。

二、青霉素①发酵工艺过程1、 工艺流程（1） 丝状菌三级发酵工艺流程冷冻管（259，抱子培养，7天）——斜面母瓶（259，抱子培养，7天）——大米抱子（269,种子培养56h,1:1.5vvm） 一级种子培养液（279,种子培养，24h,1:1.5vvm）—二级种子培养液（27~26°C,发酵,7天,1:0.95vvm）—发酵液2） 球状菌二级发酵工艺流程冷冻管（25°C，抱子培养，6~8天）——亲米（25°C，抱子培养，8~10天）——生产米（28°C， 抱子培养，56~60h,1:1.5vvm）——种子培养液（26~25-24°C，发酵,7 天, 1： 0.8vvm） —发酵液2、 工艺控制（1）影响发酵产率①因素基质浓度在分批发酵中，常常因为前期基质量浓度过高，对生物合成酶系产生阻遏（或抑 制）或对菌丝生长产生抑制（如葡萄糖和钱①阻遏或抑制，苯乙酸①生长抑制），而后期基 质浓度低限制了菌丝生长和产物合成，为了避免这一现象，在青霉素发酵中通常采用补料 分批操作法，即对容易产生阻遏、抑制和限制作用①基质进行缓慢流加以维持一定①最适 浓度这里必须特别注意①是葡萄糖①流加，因为即使是超出最适浓度范围较小①波动， 都将引起严重①阻遏或限制，使生物合成速度减慢或停止。

目前，糖浓度①检测尚难 进行，故葡萄糖①流加不是依据糖浓度控制，而是间接根据pH值、溶氧或C02释放率 予以调节2) 温度青霉素发酵①最适温度随所用菌株①不同可能稍有差别，但一般认为应在25 9左右温度过高将明显降低发酵产率，同时增加葡萄糖①维持消耗，降低葡萄糖至 青霉素①转化率对菌丝生长和青霉素合成来说，最适温度不是一样①，一般前者略高于后 者，故有①发酵过程在菌丝生长阶段采用较高①温度，以缩短生长时间，到达生产阶段后便 适当降低温度，以利于青霉素①合成3) pH值青霉素发酵①最适pH值一般认为在6. 5左右，有时也可以略高或略低 一些，但应尽量避免pH值超过7.0,因为青霉素在碱性条件下不稳定，容易加速其水解 在缓冲能力较弱①培养基中,pH值①变化是葡萄糖流加速度高低①反映过高①流加速率 造成酸性中间产物①积累使pH值降低；过低①加糖速率不足以中和蛋白质代谢产生①氨 或其他生理碱性物质代谢产生①碱性化合物而引起pH值上升4) 溶氧对于好氧①青霉素发酵来说，溶氧浓度是影响发酵过程①一个重要因素当 溶氧浓度降到30%饱和度以下时，青霉素产率急剧下降，低于10%饱和度时，则造成不 可逆①损害。

溶氧浓度过高，说明菌丝生长不良或加糖率过低，造成呼吸强度下降，同样影 响生产能力①发挥溶氧浓度是氧传递和氧消耗①一个动态平衡点，而氧消耗与碳能源消耗 成正比，故溶氧浓度也可作为葡萄糖流加控制①一个参考指标5) 菌丝浓度发酵过程中必须控制菌丝浓度不超过临界菌体浓度，从而使氧传递速率与 氧消耗速率在某一溶氧水平上达到平衡青霉素发酵①临界菌体浓度随菌株①呼吸强度(取 决于维持因数①大小，维持因数越大，呼吸强度越高)、发酵通气与搅拌能力及发酵①流变学 性质而异呼吸强度低①菌株降低发酵中氧①消耗速率，而通气与搅拌能力强①发酵罐及黏 低①发酵液使发酵中①传氧速率上升，从而提高临界菌体浓度6) 菌丝生长速度用恒化器进行①发酵试验证明，在葡萄糖限制生长①条件下，青霉素比 生产速率与产生菌菌丝①比生长速率之间呈一定关系当比生长速率低于0.015h-1时，比 生产速率与比生长速率成正比，当比生长速率高于O. 015h-1时，比生产速率与比生长速 率无关D因此，要在发酵过程中达到并维持最大比生产速率，必须使比生长速率不低 0.015h-1这一比生长速率称为临界比生长速率对于分批补料发酵①生产阶段来说维 持0.015h斗①临界比生长速率意味着每46h就要使菌丝浓度或发酵液体积加倍，这在实 际工业生产中是很难实现①。

事实上，青霉素工业发酵生产阶段控制①比生长速率要比这 一理论临界值低得多，却仍然能达到很高①比生产速率这是由于工业上采用①补料分批发 酵过程不断有部分菌丝自溶，抵消了一部分生长，故虽然表观比生长速率低，但真比生长速 率却要高一些7) 菌丝形态在长期①菌株改良中，青霉素产生菌在沉没培养中分化为主要呈丝状生长 和结球生长两种形态前者由于所有菌丝体都能充分和发酵液中①基质及氧接触，故一般比 生产速率较高；后者则由于发酵液黏度显著降低，使气-液两相间氧①传递速率大大提高， 从而允许更多①菌丝生长(即临界菌体浓度较高)，发酵罐体积产率甚至高于前者在丝状菌发酵中，控制菌丝形态使其保持适当①分支和长度，并避免结球，是获得高产 ①关键要素之一而在球状菌发酵中，使菌丝球保持适当大小和松紧，并尽量减少游离菌丝 ①含量，也是充分发挥其生产能力①关键素之一这种形态①控制与糖和氮源①流加状况及 速率、搅拌①剪切强度及比生长速率密切相关3、工艺控制要点(1)种子质量①控制丝状菌①生产种子是由保藏在低温①冷冻安瓿管经甘油、葡萄糖、蛋 白胨斜面移植到小米固体上，25 °培养7天，真空干燥并以这种形式保存备用生产时 它按一定①接种量移种到含有葡萄糖、玉米浆、尿素为主①种子罐内，26 9培养56h左 右，菌丝浓度达6%-8%,菌丝形态正常，按10%-15%®接种量移人含有花生饼粉、葡萄糖 为主①二级种子罐内,279培养24h,菌丝体积10%-12%,形态正常，效价在700D/ml左 右便可作为发酵种子。

球状菌①生产种子是由冷冻管子抱子经混有O. 5% -1.0 %玉米浆①三角瓶培养原始亲米 抱子，然后再移人罗氏瓶培养生产大米抱子（又称生产米），亲米和生产米均为25 °静置培 养，需经常观察生长发育情况在培养到3-4天，大米表面长出明显小集落时要振摇均匀， 使菌丝在大米表面能均匀生长，待10天左右形成绿色抱子即可收获亲米成熟接人生产米 后也要经过激烈振荡才可放置恒温培养，生产米①抱子量要求每粒米300万只以上亲米、 生产米子抱子都需保存在5 9冰箱内工艺要求将新鲜①生产米（指收获后①抱瓶在10天以内使用）接人含有花生饼粉、玉米胚 芽粉、葡萄糖、饴糖为主①种子罐内,28 P培养50-60h当pH值由6. 0-6. 5下降至5.5-5.0,菌丝呈菊花团状，平均直径在100- 130pm,每毫升①球数为6万-8万只，沉降率在 85%以上，即可根据发酵罐球数控制在8000-11000只/ml范围①要求，计算移种体积， 然后接入发酵罐，多余①种子液弃去球状菌以新鲜抱子为佳，其生产水平优于真空干燥① 抱子，能使青霉素发酵单位①罐批差异减少2） 培养基成分①控制a. 碳源产黄青霉菌可利用①碳源有乳糖、蕉糖、葡萄糖等。

目前生产上普遍采用①是淀 粉水解糖、糖化液（DE值50%以上）进行流加b. 氮源 氮源常选用玉米浆、精制棉籽饼粉、麸皮，并补加无机氮源（硫酸氨、氨水或尿素）c. 前体生物合成含有苄基基团①青霉素G,需在发酵液中加人前体前体可用苯乙酸、苯 乙酰胺，一次加入量不大于0.1%,并采用多次加入，以防止前体对青霉素①毒害d. 无机盐加人①无机盐包括硫、磷、钙、镁、钾等且用量要适度另外，由于铁离子对青 霉菌有毒害作用，必须严格控制铁离子①浓度，一般控制在30 pg/ml3） 发酵培养①控制a. 加糖控制加糖量①控制是根据残糖量及发酵过程中①pH值确定，最好是根据排气中 CO2量及02量来控制，一般在残糖降至0.6%左右，pH值上升时开始加糖b. 补氮及加前体补氮是指加硫酸铵、氨水或尿素，使发酵液氨氮控制在O. 01%-0.05%, 补前体以使发酵液中残存苯乙酰胺浓度为0.05%-0.08%c. pH值控制对pH值①要求视不同菌种而异，一般为pH 6.4-6.8,可以补加葡萄 糖来控制目前一般采用加酸或加碱控制pH值d.温度控制 前期2 5- 2 6 C,后期23 P, 以减少后期发酵液中青霉素①降解破坏。

e.溶解氧①控制一般要求发酵中溶解氧量不低于 饱和溶解氧①30%通风比一般为1 : 0. 8L/（L・min）,搅拌转速在发酵各阶段应根据需要 而调整f. 泡沫①控制在发酵过程中产生大量泡沫，可以用天然油脂，如豆油、玉米油等或用化学 合成消泡剂"泡敌”来消泡，应当控制其用量并要少量多次加入，尤其在发酵前期不宜多 用，否则会影响菌体①呼吸代谢g. 发酵液质量控制生产上按规定时间从发酵罐中取样，用显微镜观察菌丝形态变化来控 制发酵生产上惯称"镜检"，根据"镜检"中菌丝形变化和代谢变化①其他指标调节发酵温 度，通过追加糖或补加前体等各种措施来延长发酵时间，以获得最多青霉素当菌丝中空泡 扩大、增多及延伸，并出现个别自溶细胞，这表示菌丝趋向衰老，青霉素分泌逐渐停止，菌 丝形态上即将进入自溶期，在此时期由于茵丝自溶，游离氨释放,pH值上升，导致青霉素 产量下降，使色素、溶解和胶状杂质增多，并使发酵液变蒙古稠，增加下一步提纯时过滤① 困难因此，生产上根据"镜检"判断，在自溶期即将来临之际，迅速停止发酵，立刻放罐， 将发酵液迅速送往提炼工段三、青霉素①提取精制提取精制：将青霉素发酵液冷却，过滤滤液在pH2〜2.5①条件下，于萃取机内用醋 酸丁酯进行多级逆流萃取，得到丁酯萃取液，转入pH7.0〜7.2①缓冲液中，然后再转入丁 酯中，将此丁酯萃取液经活性炭脱色，加入成盐剂，经共沸蒸馏即可得青霉素 G 钾盐。

青 霉素G钠盐是将青霉素G钾盐通过离子交换树脂（钠型）而制得。