开题报告--漆酶不同同工酶的分离纯化及性质研究.doc

0福州大学本科生毕业设计（论文）开题报告姓 名 许婷 学号 080800135 专 业 生物技术题 目 漆酶不同同工酶的分离纯化及性质研究一、研究背景、概况及意义漆酶( p-diphenol: oxygen oxidoreductase; EC1.10.3.2)因为首次由日本漆树得到而得名，它是一种含铜的糖蛋白氧化酶，和植物中的抗坏血酸氧化酶、哺乳动物血浆铜蓝蛋白酶同属于铜蓝氧化酶蛋白家族的一员漆酶广泛存在于担子茵、半知菌和子囊菌中，其中主要产生于担子菌中的白腐菌漆酶是简单的多铜氧化酶，在其催化结构中心有3个高度保守的铜原子结合位点，结合四个铜原子，每个铜原子在催化机制中都有重要作用漆酶能催化分子氧通过4个电子还原成水，并伴随着一些酚类底物的氧化 其催化的底物广泛, 包括有酚类及其衍生物、芳胺及其衍生物、羧酸及其衍生物、甾体激素和生物色素、氨基的吲哚衍生物等, 并且在介体N-hydroxy benz-otriazole( HBT ) 、[ 2, 2-azinobis ( 3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonate] ( ABTS) 等存在的情况下还可以氧化非酚型底物。

由于这些特性, 漆酶在纸浆漂白、纺织印染染料脱色、果汁饮料澄清、工业废水处理以及生物修复等行业具有广泛的应用前景 尤其在制浆造纸方面, 漆酶可以直接氧化纸浆的生色物质木质素, 被认为是最有可能取代纯化学漂白剂, 解决含氯、硫化合物的污染, 最终实现造纸业的清洁性生产一个有效途径, 因而漆酶的研究成为该行业的一个世界性研究热点目前，相关研究仍主要集中在筛选与培育优良的产漆酶菌株、探索最佳发酵方式和条件以及对漆酶进行分离纯化及其性质研究等方面但已报道的产漆酶菌株还不多，酶产量普遍不高，且发酵周期较长( 9 ～14d)，目前已有多种不同来源的真菌漆酶得到分离和纯化漆酶同工酶是研究漆酶另一个很重要的方面,是漆酶源的补充,也促进了漆酶研究的深入发展漆酶同工酶的报道很多 ,尤其是真菌漆酶,几乎每一种被报道产漆酶的真菌,则必定含有几种同工酶本实验室前期已筛选出一株高产漆酶的白腐真菌菌株Y-1，在优化培养基中发酵，本课题针对其发酵液中产生的漆酶同工酶进行分离纯化和部分酶学性质进行研究，并研究不同同工酶对染料的脱色能力，可为以后进一步酶学性质的开展及应用于工业染料废水处理奠定理论基础22、研究主要内容1．漆酶的分离纯化［1］硫酸铵沉淀［2］离子交换层析［3］凝胶过滤层析2．漆酶同工酶的酶学性质研究［1］分子量、等电点、糖含量测定［2］最适作用 pH 和 pH 稳定性试验［3］最适作用温度和温度稳定性试验［4］金属离子和抑制剂对酶活性的影响［5］动力学常数 Km 值测定3．漆酶在染料脱色中的应用研究利用实验室已优化的脱色体系条件，研究不同同工酶对染料的脱色能力。

3三、研究步骤、方法及措施1.漆酶的分离纯化白腐菌液态发酵产漆酶主要通过以下几个步骤分离纯化：发酵液→离心→粗酶液→硫酸铵沉淀→透析→离子交换层析→超滤浓缩→凝胶过滤层析→电泳验证［1］粗酶液制备通过液态发酵产酶，使用低温高速离心机得到上清液，置于 4℃冰箱中保存备用［2］硫酸铵沉淀取等量粗酶液样品，缓慢分阶段加入研磨过的硫酸铵固体，分别达到不同的饱和度，测定各饱和度沉淀后上清液的漆酶酶活，以确定最适的硫酸铵分级沉淀的范围［3］离子交换层析将酶液稀释于一定 pH 缓冲液中上阴离子柱,用 NaCl 溶液梯度洗脱将在 280nm处有吸收峰的管子收集起来，用 ABTS 法测其酶活，再将有漆酶活性的部分收集起来［4］凝胶过滤层析将上步收集的酶液再经过凝胶柱进行洗脱，收集洗脱液，测定 A280 及酶活，将有漆酶活性的部分收集起来，进行电泳检测其纯度［5］同工酶鉴定：Native-PAGE纯化效果：计算各个纯化步骤的纯化倍数和回收率42.漆酶同工酶的性质研究［1］基本性质分子量测定:SDS-PAGE蛋白含量测定：按考马斯亮蓝G250染色法[4]进行糖含量测定：苯酚-硫酸法［2］米氏常数(Km) 值的测定将漆酶酶液与不同浓度的底物反应后测其酶活力。

由米式方程确定酶反应速度与底物浓度之间的定量关系，用Lineweaver-Burk 作图法求出酶对该底物的Km 值［3］最适作用温度和温度稳定性试验将酶活测定体系分别在不同温度下保温后，测定酶活力，分析温度对漆酶活力的影响将酶液置于不同温度的水浴锅中一定时间，分析温度对漆酶稳定性的影响［4］最适作用pH和pH稳定性试验用pH计调制不同pH的缓冲液，在最适温度下测定酶活，分析pH对漆酶活力的影响将漆酶分别加入不同pH缓冲液中，保温一定时间测酶活，分析 pH对漆酶稳定性的影响［5］金属离子和抑制剂对酶活性的影响在酶的反应液中加入不同的金属离子和抑制剂，测定酶活力以不加任何因子的反应液的酶活力为对照，分析金属离子和抑制剂对漆酶活力的影响3.漆酶在染料脱色中的应用研究利用实验室已优化的脱色体系条件，研究不同同工酶对染料的脱色能力四、研究进度计划2012.2.27---2012.3.4 查阅文献，撰写文献综述、前期实验准备；2012.3.5---2012.3.12 开题报告；2012.3.13---2012.3.25 漆酶的分离纯化；2012.3.26---2012.4.21 漆酶的酶学性质研究；2012.4.22---2012.5.17 漆酶在染料脱色中的应用研究；2012.5.18～2012.5.26 撰写毕业论文；2011.6.1～2011.6.8 论文答辩。

5五、参考文献[1] 林卫军,经艳,卫力等.灵芝漆酶的分离纯化及其部分酶学性质研究.广西科学,2009,16(1):82-86[2] 陈琼华,周玉萍,陈晓等.韦伯灵芝漆酶的分离纯化及其性质.食品科学,2010,31(5):201-205.[3] 万云洋,杜予民.漆酶来源与绿色化学应用.林产化学与工业,2008,28(6):100-108.[4] 李建武,袁明秀.生物化学实验原理和方法.北京:北京大学出版社,2000.[5] 吴晴. 白腐真菌及其漆酶的应用研究[J]. 安徽科技, 2010(3): 47-48.[6] 吕世翔, 王秋玉. 白腐菌在木质纤维素降解中的应用进展[J]. 森林工程, 2009, 25(4): 26-31.[7] 王志新, 施晓燕, 蔡宇杰等. 白腐真菌 SYBC2L2 漆酶的分离纯化及其在毛纺染料脱色中的应用[J]. 生物技术通报, 2009(8): 156-165.[8] 王祎宁，赵国柱，谢响明等.漆酶及其应用的研究进展［J］.生物技术通报，2009(5) :35--38.[9] Forootanfar H., Faramarzi M.A., Shahverdi A.R., etal. Purification and biochemical characterization of extracellular laccase from the ascomycete Paraconiothyrium variabile[J]. Bioresour. Technol, 2011, 102(2): 1808-1814.[10]Zhang G., Y. Wang, X. Zhang, etal. Purification and characterization of a novel laccase from the edible mushroom Clitocybe maxima[J]. Process Biochemistry, 2010, 45(5): 627-633.[11]孙巍, 夏春雨, 蔡和辉等. 毛云芝菌固体发酵产漆酶的分离纯化及酶学性质[J]. 食品与生物技术学报, 2010, 29(5): 748-754.[12]卢磊, 赵敏, 赵丽艳等. 重组血红密孔菌漆酶的纯化\酶学性质及其染料脱色研究[J].北京林业大学学报, 2010,32(6):125-129.[13]赵亮亮. 红芝发酵产漆酶及其在染料脱色中的应用研究[D]. 广西师范大学硕士论文, 2010.[14]Aghaie-Khouzani M., H. Forootanfar, M. Moshfegh, etal. Decolorization of some synthetic dyes using optimized culture broth of laccase producing ascomycete Paraconiothyrium variabile[J]. Biochemical Engineering, 2012, 60(15): 9-15.[15]朱林, 洪宇植, 方泽民等. 真菌漆酶对蒽醌和偶氮类活性染料的脱色[J]. 中国科技论文, 2010, 5(3): 224-227[16]王维乐. Paraconiothyrium variabile GHJ-4 漆酶的发酵、分离纯化及其酶学性质的研究[D]. 山东农业大学硕士论文, 2011.2学生签名：　　　　　 　 年　　月　　日指导教师意见（对本课题的深度、广度及工作量的意见及开题是否通过）：通过 □ 完善后通过 □ 未通过 □指导教师签名：　　　　　 　 年　　月　　日注：开题报告用 A4 纸打印装订在毕业设计（论文）任务书后，学生可根据开题报告的长度加页。

开题是否通过请指导教师在□内打“√” 。