嗜冷菌检测方法.docx

嗜冷菌检测方法嗜冷菌概念 牛乳挤出来要经过冷却处理，降低乳温从而抑制细菌的生长繁殖，但在低温条件下有些 细菌也能生长，而这类细菌即为低温菌低温菌又包括嗜冷菌和耐冷菌嗜冷菌主要存在于 低温环境中，包括两类微生物，一类是专性嗜冷菌（Psychrophiles最高生长温度不高于 20°C，最适生长温度为15°C，在0°C仍然可以生长繁殖的微生物；另一类为兼性嗜冷菌（PsychrotrophicS，又名耐冷菌，最高生长温度高于20C，最适生长温度高于15°C，在 0〜5C仍然可以生长繁殖的微生物专性嗜冷菌主要分布在常冷低温区，对温度的变化比较 敏感，20C以上即很快引起死亡；而兼性嗜冷菌分布范围较宽，从常冷到不稳定的低温环境 中都能分离到方法一：基准法一6・5°C,培养10天（仲裁法）1 范围此方法用于原奶和巴氏杀菌奶的检验2 方法提要2.1 准备好倒有培养基和定量稀释适当倍数的被测样品的培养皿2.2将培养皿在6.5C条件下培养10天2.3 根据培养皿中的菌落数计算出每毫升样品中的菌落数，选择菌落数比较恰当的稀释倍数比较得当的培养皿进行菌落计数3 试剂3.1 稀释液生理盐水：0.85％的氯化钠水溶液，灭菌。

3.2 培养基平板计数琼脂23.5g+脱脂奶粉1g,溶于1000ml水中必要时用滤纸过滤调节pH值为6.9±0.1将培养基分装倒入三角瓶中，每瓶100—150ml在121 土 1°C下灭菌15min，如果培养基马上要用，用水浴锅冷却到46± 1°C如果不是，则为了不耽误培养基的使用，在实验开始前，将培养基放入沸腾水浴中使其完全熔化，然后再放入水浴中冷却到46±1°C注：其中脱脂粉应该不含有抑菌剂4 仪器及玻璃器皿微生物实验室常用仪器，制备和稀释样品所用仪器以及：4.1培养箱，可以调节并保持到6.5±0.5C4.2 pH计，带温度补偿，精度为0.14.3水浴，可以保持到46±1°C4.4三角瓶，250—300ml,带合适的塞子4.5 吸管，用嘴吸的吸管要用脱脂棉或纤维素塞紧4.6培养皿，玻璃或塑料的，直径在90—100mm5. 操作步骤5. 1样品的稀释及培养5.1.1以无菌操作，将25ml样品注入含有225ml灭菌生理盐水的三角瓶内，充 分混匀，制成1：10的稀释液5.1.2用1ml灭菌吸管吸取1： 10的稀释液1ml，沿管壁徐徐注入含有9ml灭菌 生理盐水的试管内，充分混匀，制成1：100的稀释液。

5.1.3另取1ml灭菌吸管，按上项操作顺序，作10倍递增稀释液，如此每递增 稀释一次，即换用1支吸管5.1.4根据对样品污染情况的估计，选择2—3个适宜稀释度，分别在作10倍递 增稀释的同时，即以吸取该稀释度的吸管移取1ml稀释液于灭菌平皿内，每个稀 释度做两个平皿注：其他稀释方法可以使用，例如第一步稀释可以是10ml检测样品注入到90ml稀释液中， 或11ml检测样品注入到99ml稀释液中当样品和稀释液用量更大，方法的精密度和准确度 就更高5.1.5稀释液移入平皿后，应及时将凉至46C的培养基（可放置于46±1C水浴 保温）注入平皿约15ml，并转动平皿使混合均匀同时将培养基倾入空的灭菌 平皿内作空白对照注：从稀释样品到倾倒培养基，整个操作过程不应超过1 5min5.1.6待培养基凝固，翻转平板，放入6.5C培养箱内培养10天 注：每叠皿不应超过6个，每叠皿之间以及与培养箱的壁之间应保持一定的间隙5.2 菌落计数方法 对平皿进行菌落计数时，应在柔和的光线下计数为了便于计数，可使用适当的放大镜和（或）菌落计数器以防极小的菌落遗漏，以及避免将平皿中杂质 颗粒进行计数仔细检查可疑的物质，如需要可使用更高倍数的放大镜，以区别菌落和外来物质。

5.3 菌落计数的报告5.3.1 平板菌落数的选择平板有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板作 为该稀释度的菌落数，若片状菌落不到平板的一半，而另一半菌落分布又很均匀， 即可计算半个平板后乘2 以代表全皿菌落数平板内若有链状菌落生长时（菌落 之间无明显界限），若仅有一条链，可视为一个菌落；如果有不同来源的几条链， 则应将每条链作为一个菌落计5.3.2 稀释度的选择及报告5.3.2.1 选取菌落数在10-300之间的培养皿作为计数的测定标准5.3.2.2 若有两个稀释度，其生长的菌落数在10-300之间，则按下面的方法计 数计算每ml牛奶中微生物的个数N,用以下的公式：EcN = （n +0.1n ）d12这里Ec：是所有皿上菌落数的总和n :是第一个稀释度培养皿的个数1n :是第二个稀释度培养皿的个数2d： 是与第一个稀释液相对应的稀释因子结果保留两位有效数字,后面的数字以四舍五入计算当第三位数是5时,看其 左边的数是奇偶数进行数字取舍；如 28500 进行数字取舍为 28000, 11500为 12000结果以科学计数法表示举例微生物计数给出以下的结果（包括两个带盖培养皿）：在第一个稀释度（10E-2）： 168和215个菌落在第二个稀释度（10E-3）： 14和25个菌落Ec168+215+14+25422=19182（n +0.1n ）d [2+（0.1*2）]*10-2 0.02212根据上面所说结果进行取舍为19000,结果为1.9X104个/ml。

注：如果有两个以上可以计数的稀释度，公式应修改为用多个稀释度进行计算如为三个稀 释度,由下面的公式可计算出每毫升中微生物的数量EcN = （n1+0.1n2+0.01n3）d5.3.2.3 如果菌落数均小于 10,则按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数, 报告每毫升牛奶菌落的估计数5.3.2.4 如果菌落数均超过 300,则按稀释度最高的平均菌落数乘以稀释倍数, 报告每毫升牛奶菌落的估计数6、参考标准IDF标准101A： 1991——乳中嗜冷菌的检验方法二：快速法一21°C，培养25h1范围本标准描述的是通过21C时快速菌落计数技术进行嗜冷菌菌数估算的方法 此方法用于原奶和巴氏杀菌奶的检验—当需要很快的得到嗜冷菌估算值的时候2方法提要2.1 准备好倒有培养基和定量稀释适当倍数的被测样品的培养皿2.2将培养皿在21C条件下培养25h2.3 根据培养皿中的菌落数计算出每毫升样品中的菌落数,选择菌落数比较恰当 的稀释倍数比较得当的培养皿进行菌落计数3试剂3.1 稀释液生理盐水：0.85％的氯化钠水溶液,灭菌3.2 培养基平板计数琼脂23.5計脱脂奶粉1g,溶于1000ml水中必要时用滤纸过滤。

调节 pH值为6.9±0.1将培养基分装倒入三角瓶中，每瓶100—150ml在121±1°C 下灭菌15min,如果培养基马上要用，用水浴锅冷却到46±1C如果不是，则 为了不耽误培养基的使用，在实验开始前，将培养基放入沸腾水浴中使其完全熔 化，然后再放入水浴中冷却到46±1C注：其中脱脂粉应该不含有抑菌剂4仪器及玻璃器皿微生物实验室常用仪器，制备和稀释样品所用仪器以及：4.1培养箱，可以调节并保持到21±1°C4.2 pH计，带温度补偿，精度为0.14.3水浴，可以保持到46±1C4.4三角瓶，250—300ml，带合适的塞子4.5 吸管，用嘴吸的吸管要用脱脂棉或纤维素塞紧4.6培养皿，玻璃或塑料的，直径在90—100mm5.操作步骤5. 1样品的稀释及培养 稀释步骤同方法一中5. 1. 1—5. 1. 55.1.6待培养基凝固翻转平板，放入21C培养箱内培养25h注：每叠皿不应超过6个，每叠皿之间以及与培养箱的壁应保持一定的间隙5. 2菌落计数方法同方法一中5. 2 5.3 菌落计数的报告同方法一中5. 3 6参考标准IDF标准132A——乳中嗜冷菌快速检测方法，21C，25h。