蛋白质的定量分析方法.docx

蛋白质的定量分析方法1． 蛋白质的常规检测方法1.1 凯氏定氮法 一种最经典的蛋白质检测方法原理：样品中含氮有机化合物与浓硫酸在催 化剂作用下共热消化，含氮有机物分解产生氨，氨又与硫酸作用变成硫酸铵然 后加碱蒸馏放出氨，氨用过量的硼酸吸收，再用盐酸标准溶液滴定求出总氮量换 算为蛋白质含量优点：范围广泛、测定结果准确、重现性好缺点：操作复杂 费时、试剂消耗量大1.2 双缩脲法 常用于需要快速但并不需要十分精确的蛋白质检测原理：双缩脲是三分子 的脲经180°C左右加热，放出一份子氨后得到的产物，在强碱性溶液中，双缩脲 与硫酸铜形成紫色络合物（肽链中的氮原子和铜离子配价结合），称为双缩脲反 应紫色络合物颜色的深浅和蛋白质浓度成正比，因此可用来测定蛋白质含量 优点：较快速、干扰物质少、不同蛋白质产生的颜色深浅相近缺点：灵敏度差、 三羟甲基氨基甲烷、一些氨基酸和EDTA等会干扰该反应1.3 Folin酚试剂法 原理：与双缩法大体相同，利用蛋白质中的肽键和铜离子结合产生双缩脲反应 同时也由于 Folin 酚试剂中的磷钼酸 磷钨酸试剂被蛋白质的酪氨酸和苯丙氨酸 残基还原，产生深蓝色的钼蓝和钨蓝的混合物。

在一定条件下，蓝色深度与蛋白 的量成正比，由此可测定蛋白质的含量优点：灵敏度高、对水溶性的蛋白质含 量的测定很有效缺点：费时，要精确控制操作时间；Folin酚试剂的配制比较 繁琐，且酚类和柠檬酸、硫酸铵、 Tris 缓冲液、甘氨酸、糖类、甘油、还原剂（二 硫代苏糖醇、巯基乙醇）、EDTA和尿素均会干扰反应1.4 紫外吸收法原理：蛋白质中的酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸残基使其在 280nm 处具有紫 外吸收，其吸光度与蛋白质含量成正比此外，蛋白质溶液在 280nm 处的吸光 值与肽键含量成正比利用一定波长下蛋白质溶液的吸光值与蛋白质含量的正比 关系可以测定蛋白质含量优点：简便、灵敏、快速、不消耗样品，测定后能回 收缺点：测定蛋白质含量的精确度差、专一性差；干扰物质多，若样品中含有 嘌呤、嘧啶等能吸收紫外光的物质会出现较大的干扰1.5考马斯亮蓝法（Bradford法）原理：考马斯亮蓝G250在酸性溶液中与蛋白质中的碱性氨基酸（特别是精 氨酸）和芳香族氨基酸残基相结合（蛋白质与染料间的疏水作用也很重要），使 染料最大吸收峰的位置从465nm变为595nm,溶液的颜色也有棕黑色变为蓝色， 在595nm下测定的吸光度值与蛋白质溶度成正比。

优点：灵敏度高，测定快速、 简便，干扰物质少，不受酚类、游离氨基酸和缓冲剂、络合剂的影响，适合大量 样品的测定缺点：由于各蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸含量不同，因此用 于不同蛋白质测定时有较大的偏差Bradford 法一般注意事项： 1.不要用石英杯做比色（染料会与之结合），使 用玻璃或塑料为佳，使用后用甲醇或去污剂来洗掉结合的痕量染料； 2.若用同一 比色杯，应先测定低浓度样品避免误差；3•选择570610nm波长；4使用不同公 司生产的染料可能得到不同结果； 5.使用高质量试剂和水； 6.要使样品浓度落在 标准曲线线性范围内；7•最好用Y球蛋白或卵清蛋白，因为BSA会比其他多数 蛋白质结合多一倍的染料，所以用BSA时会低估蛋白质含量，但是测定血清蛋 白时使用BSA更准确一般实验步骤：1•染色液配制：取100g考马斯亮蓝G250溶于50ml95%乙 醇中，再与100ml85%磷酸混合，用蒸馏水补足至1L使用Whatmanl号滤纸过 滤后置于棕色瓶中室温保存即可，若有沉淀产生用前应过滤 2.酶标板（96 孔） 测定：取0、2、4、6、10、15、20ul的BSA标准蛋白质溶液（lmg/ml）到酶标板 孔中；取最多 20ul 蛋白质样品到单独孔中；加入40ulBradford试剂到所有孔；加水补足到 200ul；测定 595nm 处吸光值。

一种改良的 Bradford 法：尽管Bradford法抗干扰能力较强，但是一些碱性试剂（尿素、碱性载体两性 电解质）还是会影响G250与蛋白质结合所以在加入染料之前使用酸来中和样 品能够改善效果由于有未与蛋白质结合的自由染料存在，所以测定的标准曲线 不是线性的（做标准曲线要准确些）据报道，使用595nm和450nm双波长测定 可以有效解决这一问题（水做空白组），在增加准确度的同时，还能够将灵敏度 提高十倍注意：样品中含有SDS时不使用该方法）实验步骤：准备阶段：染色液：按照常规配制，4°C保存；裂解液：9mol/L尿素、4% （体 积分数）NP-40、20g/L的两性电解质、2%巯基乙醇；蛋白质标准品：用样品溶 液（裂解液）配成5mg/L，分装-20C冻存以保证重复性（-20C保存6-8个月、- 80 C保存1年）实验操作：从-20C冰箱中取出标准品和裂解溶液，充分溶解；标准品 12000rpm,3min；样品 12000rpm,20min 使之澄清；新鲜配制0.1mol/LHCI （10ul/管）并加入纯水（80ul每管）；按下表数值分别配好标准品、样品溶液，轻轻混匀（振荡仪）：标品含量ug510152025304050标品体积ul123456810样品体积ul98765420盐酸ul1010101010101010水ul8080808080808080过滤染色液后每管加取3.5ml，用振荡器轻微摇匀5min；595nm检测。

用一次性比色杯（反应5min可充分显色，但10-15min沉淀开 始出现，尤其高溶度蛋白在酸性条件下易产生沉淀）；做标准曲线计算分析2． 蛋白质的电化学检测方法2.1 蛋白芯片技术原理：将各种蛋白质固定于载玻片等各种载体介质上成为检测的芯片，然后 用标记特定荧光物质的抗体与芯片上的蛋白质相匹配结合，抗体上的荧光将指示 对应蛋白质及其表达数量优点：快速、低成本2.2 电化学免疫传感器 原理：电化学免疫传感器是基于抗体抗原反应，可进行特异性定量分析的自给式 的集成器件，抗体、抗原是分子识别原件且与电化学传感元件直接接触，并通过 传感元件把某种化学物质浓度信号转变为相应的电信号3． 蛋白质的分子生物学检测方法3.1邻位连接技术原理 首先将不同萊DNA单链兮另I与蛋白质识别分子相结合影成PLA探北 经过类似萌 辰免疫吸附法^ELISA：巾的温肓过程，2負含衣云司DNA序歹［的PLA探针合同时结 合到辰一个待测蛋左贡分子上.此时：2圣探卜的DN凸尾部便在空闻上紧密靠近. 在过量的互补迁接序列和NDA连接酶的作用卜.2条探针DNA屋部的游离X端和 士端与互补序列杂交并发生连接反应,形成一个环狀的蛋白质-蛋白识别分子-单锥 ONA复合物。

该宣台呦重的多少，芹全副决于样品口咕测亘勻质分子的号，故叮用 丁蛋白质的走量分析*优点:检测灵敏度高、检测特异性强、样品损耗低、操作简单、检测设常见3.2核酸适体原理；宜按在核酸适依上艾俨修祐荧劣基回.刑壬它三靶分子结今时荧光信号的变化实现衣 靶少乂笊检厠■:修怙有荧光熄灭基团的梭酸适诂探针通过静电乍月呈阳离子荧光共规 聚合物结合，导致后者茨光熄瓦当加A.靶蛋口后：核酸适体探卜门其峙异性结合， 荧光熄灭基团匚阳倉了荧光共扼聚合旳沅高，聚合物荧光営弓得以恢复，优点：检测限低,检测线性範围广3.3电泳法原理:在碱性藉菠口’蛋白质将还原成Cu+. BCA与5+结合形成稳定的蓝紫色复合物■ 在北2nm处具有最大吸收峰,在一定条件下，此复合物的吸光度与蛋白质液度成正比 优点：诟剂单一，餐^韧趋定：锥对还原性糖类的T找敏感处，对亘也物质包捋幕月蛋白衣 増溶的表面活性物质如5D5等均兀影响缺点：反应时间长且蛋曰质乜芸茂主不可适的更3.4二甲酸奎林（BCA）法最初由 Smith 等建立，同 Lowry 法类似，也是在碱性条件下有铜离子被还原 形成亚铜离子（还原剂、金属离子螯合剂会产生干扰），亚铜离子通过与BCA反 应而被检测，。

Lowry法和BCA法灵敏度相似，但是BCA法在碱性条件下稳定，可以一步 完成反应且抗干扰能力强，形成的深紫色反应产物最大吸收波长是562nm,在一 定条件下，此复合物吸光度与蛋白质浓度成正比优点：购买方便、检测速度快、灵敏度高、对大多数表面活性剂不敏感；且 由于反应在碱性条件下进行，故绝大多数蛋白质保持在溶解状态缺点：对还原剂、金属离子螯合剂等很敏感，在裂解液中对该方法干扰最大 的成分是DTT，测定时样品需要充分稀释标准方法（0.1-1mg/ml样品）：试剂 A（ 100ml）： BCA-Na2 1g、Na2CO3・H2O 2g、C4H4O6Na2・2H2O 0.16g、NaOH 0.4g、NaHCO3 0.95g,用少量的固体 NaHCO3 或 50%NaOH 溶 液调节pH至11.25；试剂 B（20ml）：CuSO4・5H2O 0.8g；工作液配制：试剂A：试剂B=50： 1 （体积比）混合，该苹果绿溶液可室温稳定一周；试剂A、试剂B在室温下很稳定，可以长期存放；取lOOul含有lOlOOug蛋白质的样品溶液加入2ml工作液,60 °C孵育30min； 冷却至室温测定562nm（595nm）处吸光度；使用 lmg/ml 的 BSA 蛋白质标准液稀释作标准曲线。

具体实验操作步骤：1. （将蛋白质样品从2O C转移至4C溶解待用）计算工作液配置量=（样品 数+8+1） >200ul=C ml2. 样品稀释与浓缩：实验用BSA溶液为2mg/ml,而样品样品测定时浓度应 稀释或浓缩至标准曲线限行范围内（以最终OD值落在标准曲线中值为优）稀释：样品浓度过高时需进行稀释，根据要求用双蒸水稀释相应倍数，操作 在向酶标板孔中加样时体现；浓缩：样品浓度过低时需进行浓缩，a.将超滤管固定在EP管内，加入400ul 样品，llOOOrpm、5min,转移EP管底废液；b.以离心结果（超滤管内剩余液 面高低）加样品溶液进行二次、三次 离心至样品完全浓缩（最后一次离心留取400ul左右溶液与超滤管内）；c.将超滤管内液体进行反复抽打后转 移至EP管内3. 按下表将各溶液、试剂加取至酶标板孔内：12345678样品ddH2005101517.51919.520aBSA(2mg/ml)20151052.510.50b工作液200200200200200200200200200单位：ul a+b=20； a、b值根据稀释倍数而定4.振荡仪振荡5min, 37C水浴30min,用干净的细针头扎去大气泡;5.打开软件设定程序和参数，将酶标仪扳进仪器内进行测定595nm处吸光 值，导出数据进行计算。

4． 免疫法4.1免疫扩散法原理:①环狀丸疫单扩散法.将一定量的抗体（-般常用单价抗血清）与含缓神液的琼脂精 橈胶辰勺铺成适甘厚度的谨胶扳：再靶抗原滴进漑狡板的小儿巾.在合泄的浓度和星 度环境忆 经过一定的时间,抗原由彳迅向四周扩散（呈辐射狀）,耳已沉匀在琼脂糖 疏胶巾的抗相巴作月3为抗取扩散到一运的］t离，戸川抗原页休的懺度比例合造Ej 形成沫汽滾耳，这一沐沈早一和珀頁杭体复W物杭体的氓厦一宣，抗埔（71琢腔精凝 胶扩蔽形成防汎沅冲冉增大，辽十沉沅环的丈4曲和）于忙圧探.夏在一疋范151内土线 性关系,这样即可定量测定抗原物质-待删样品中蛋白质的含量②职叵犷歆法；一宦浓度的琼j旨。