用考马斯亮蓝G.docx

呵呵 你的自己检查一下你的仪器蛋白质浓度的测定(四)——考马斯亮蓝染色法目的要求学习考马斯亮蓝(Coomassie Brilliant Blue)法测定 蛋白质浓度的原理和方法实验原理考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度，是利用蛋白质一染料结合的原理，定 量的测定微量蛋白浓度的快速、灵敏的方法考马斯亮蓝G-250存在着两种不同的颜色形式，红色和蓝色它和蛋白质通过范德华力结合，在一定蛋 白质浓度范围内，蛋白质和染料结合符合比尔定律(Beer’s law)此染料与蛋白质结合后颜色有红色形式 和蓝色形式，最大光吸收由465nm变成595nm，通过测定595nm处光吸收的增加量可知与其结合蛋白质 的量蛋白质和染料结合是一个很快的过程，约2min即可反应完全，呈现最大光吸收，并可稳定1h，之后，蛋 白质一染料复合物发生聚合并沉淀出来蛋白质一染料复合物具有很高的消光系数，使得在测定蛋白质浓 度时灵敏度很高，在测定溶液中含蛋白质5pL/ml时就有0.275光吸收值的变化，比Lowry法灵敏4倍， 测定范围为10-100pg蛋白质，微量测定法测定范围是1—10四蛋白质此反应重复性好，精确度高，线 性关系好标准曲线在蛋白质浓度较大时稍有弯曲，这是由于染料本身的两种颜色形式光谱有重叠，试剂 背景值随更多染料与蛋白质结合而不断降低，但直线弯曲程度很轻，不影响测定。

此方法干扰物少，研究表明：NaCl, KCl，MgCl2，乙醇，(NH4) 2SO4无干扰强碱缓冲液在测定中有一 些颜色干扰，这可以用适当的缓冲液对照扣除其影响°Tris,乙酸，2-巯基乙醇，蔗糖，甘油，EDTA及微 量的去污剂如Triton X-100，SDS，玻璃去污剂有少量颜色干扰，用适当的缓冲液对照很容易除掉但是， 大量去污剂的存在对颜色影响太大而不易消除试剂与器材一、试剂 考马斯亮蓝试剂：考马斯亮蓝g-250 100mg溶于50ml95%乙醇中，加入100ml85%磷酸，用蒸馏水稀释至1000ml，滤纸过滤最终试剂中含0.01%(W/V)考马斯亮蓝G-250，4.7%(W/V)乙醇二、标准和待测蛋白质溶液1 .标准蛋白质溶液结晶牛血清蛋白，预先经微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，根据其纯度用0.15mol/LNaCl配制成1mg/ml，2 .未知蛋白质溶液三、器材试管及试管架，移液管（0.1ml及5ml）, UV—2000型分光光度计操作方法一、标准法制定标准曲线取14支试管，分两组按下表a平行操作绘制标准曲线：以A595nm为纵坐标，标准蛋白含量为横坐标，在坐标纸上绘制标准曲线。

表a试管编号01234561mg/ml标准蛋白溶液/ml00.010.020.030.040.050.060.15mol/L NaCl/ml0.10.090.080.070.060.050.04考马斯亮蓝试剂/ml5ml摇匀，1h内以0号管为空白对照，在595nm处比色A595nm二、微量法制定标准曲线取12支试管，分两组按下表b平行操作绘制标准曲线：以A595nm为纵坐标，标准蛋白含量为横坐标，在坐标纸上绘制标准曲线表b试管编号012341mg/ml标准蛋白溶液/ml 00.010.020.030.040.050.15mol/L NaCl/ml0.10.090.080.070.060.05考马斯亮蓝试剂/ml5ml摇匀，1h内以0号管为空白对照，在595nm处比色A595nm三、未知样品蛋白质浓度测定测定方法同上，取合适的未知样品体积，使其测定值在标准曲线的直线范围内根据所测定的A595nm值， 在标准曲线上查出其相当于标准蛋白的量，从而计算出未知样品的蛋白质浓度（mg/ml）注意事项（1）如 果测定要求很严格，可以在试剂加入后的5—20min内测定光吸收，因为在这段时间内颜色是最稳定的。

2）测定中，蛋白一染料复合物会有少部分吸附于比色杯壁上，实验证明此复合物的吸附量是可以忽略 的测定完后可用乙醇将蓝色的比色杯洗干净思考题：根据下列所给的条件和要求，选择一种或几种常用蛋白质定量方法测定蛋白质的浓度:（1）样品不易溶解，但要求结果较准确2）要求在半天内测定60个样品3）要求很迅速地测定一系列试管（30支）中溶液的蛋白质浓度不要用 比色杯，用量大，重复性差可以这样在96孔板里面做（可以做复孔）：每孔200微升Bradford试剂，加5微升蛋白溶液，用枪混匀或着在微量振荡器上面振匀5分钟后在酶标仪上测定OD495，然后在Excel里面直接做均值，画标准曲线，OK!参考：Pierce公司的相关试剂盒考马斯亮兰法（Bradford法）（一）实验原理1976年由Bradford建立的考马斯亮兰法（Bradford法），是根据蛋白质与染料相结合的原理设计的这种 蛋白质测定法具有超过其他几种方法的突出优点，因而正在得到广泛的应用这一方法是目前灵敏度最高 的蛋白质测定法考马斯亮兰G-250染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰的位置（lmax）， 由465nm变为595nm，溶液的颜色也由棕黑色变为兰色。

经研究认为，染料主要是与蛋白质中的碱性氨 基酸（特别是精氨酸）和芳香族氨基酸残基相结合在595nm下测定的吸光度值A595，与蛋白质浓度成 正比Bradford法的突出优点是:（1） 灵敏度高，据估计比Lowry法约高四倍，其最低蛋白质检测量可达1mg这是因为蛋白质与染料结 合后产生的颜色变化很大，蛋白质一染料复合物有更高的消光系数，因而光吸收值随蛋白质浓度的变化比 Lowry法要大的多2） 测定快速、简便，只需加一种试剂完成一个样品的测定，只需要5分钟左右由于染料与蛋白质结 合的过程，大约只要2分钟即可完成，其颜色可以在1小时内保持稳定，且在5分钟至20分钟之间，颜 色的稳定性最好因而完全不用像Lowry法那样费时和严格地控制时间3） 干扰物质少如干扰Lowry法的K+、Na+、Mg2+离子、Tris缓冲液、糖和蔗糖、甘油、巯基乙醇、 EDTA等均不干扰此测定法此法的缺点是：（1） 由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此Bradford法用于不同蛋白质测定时有 较大的偏差，在制作标准曲线时通常选用g一球蛋白为标准蛋白质，以减少这方面的偏差2） 仍有一些物质干扰此法的测定，主要的干扰物质有：去污剂、TritonX-100、十二烷基硫酸钠（SDS） 和0.1N的NaOH。

如同0.1N的酸干扰Lowary法一样）3） 标准曲线也有轻微的非线性，因而不能用Beer定律进行计算，而只能用标准曲线来测定未知蛋白质 的浓度这是操作流程1. 完全溶解蛋白标准品，取10ml稀释至100ml，使终浓度为0.5mg/ml蛋白样品在什么溶液中，标准 品也宜用什么溶液稀释但是为了简便起见，也可以用0.9%NaCl或PBS稀释标准品2. 将标准品按0, 1, 2, 4, 8, 12, 16, 20微升分别加到96孔板中，加标准品稀释液补足到20微升（一般每 个梯度做五个）3. 加适当体积样品到96孔板的样品孔中，加标准品稀释液到20微升4. 各孔加入200微升G250染色液，室温放置3-5分钟5. 用酶标仪测定A595，或560-610nm之间的其它波长的吸光度6.根据标准曲线计算出样品中的蛋白浓度。