单克隆抗体制备标准化操作方案(精选).doc

单克隆抗体制备标准化操作方案目录第八章附件第一章小鼠免疫 小鼠免疫是单抗制备的关键一环，质控小鼠免疫是制备优质单抗的唯一保证好的免疫效 果：血清效价达一万以上，脾脏粘连且大小是正常鼠的两倍以上小鼠的选择：选择•所用骨髄瘤细胞同源的Balb/c健廉雌性小鼠，鼠龄在8〜12周为避 免小鼠反应不佳或免疫过程小死亡，可同时免疫3〜4只小鼠免疫原：免疫原的纯度一般并不重要但有时免疫原纯度也会造成很人影响，若杂质存在 使免疫反应减弱，或筛选方法不能区分对特意性成分反应的抗体及对杂质反应的抗体，以 及有些抗原的免疫原性十分强，即便痕迹量的存在，也会影响对所识别抗原的免疫反应 上述诸情况卜•使川纯化抗原会更有利常用的免疫方案：（一） 可溶性抗原初次免疫：50〜100 u g蛋白抗原加等体积福氏完全佐剂乳化到滴水不化即可做小鼠背部皮 下多点注射，注射体积500 M 1/只小鼠，四周后进行第二次免疫笫二次免疫：50〜100 ug （25〜50ug,为初免剂量一半）蛋口抗原（与初免等量），加等 体积福氏不完全佐剂乳化到滴水不化即可做小鼠背部皮下多点注射，注射体积500P 1/只小 鼠两周后采小鼠尾静脉血离心収血清测效价（用ELISA方法检测）效价达一万以上的小鼠融合前三天取抗原25ug （50〜100ug,与初免剂量相同）加强免疫, 尾静脉注射，注射体积200 ul/只300"/只，效价在一万以下的小鼠继续第三次免疫。

第二次免疫：50ug蛋白抗原加等体积福氏不完全佐剂乳化到滴水不化即可做小鼠腹腔注 射,注射体积500P1/只,小鼠融合前三天取抗原25yg加强免疫,注射体积200U1/只二） 颗粒性（细胞）抗原可用5X106^2X107细胞与完全佐剂混合，作皮下或腹腔注射，2飞周示重复一次，但佐剂 改为不完全佐剂，再待2〜3周后用同样剂量细胞或半量细胞静脉注射，3~4天后取脾融合 为挑选免疫反应较好的动物进行融合，笫二次免疫后10犬左右应从尾部取血，检杳抗休滴 度另外，还冇脾内注射法和体外培养法第二章饲养细胞的制备体外培养细胞时，-•般单个或极少数分散状态细胞是不能存活的（或生长不良）必需加入 一淀最的其他细胞达一定的密度才能生长得好，加入的细胞称为饲养细胞用细胞融合术 建立杂交瘤细胞时，饲养细胞的加入是不可缺少的，常用的冇正常小鼠腹腔巨噬细胞、脾 细胞、胸腺细胞，也有人用经过照射或丝裂霉素处理的纤维母细胞,如3T3或Putlet等一、 实验材料1 RPMI-1640完全培养液：具体配法见实验方法一细胞融合2. 32 HAT培养液或HT培养液：具体配法见实验方法一细胞融合2. 4和2. 51.3实验动物：Balb/c或昆明种健康小鼠（雌雄均可）1只，6〜10周龄，体重18〜22 克，本院动物中心繁殖和饲养。

每只小鼠可取得3〜5X"的滋养细胞,可供铺6块板用, 应在融合或克隆前1〜2天制备1.4离心机一台，血细胞计数板，无菌塑料离心管，96孔细胞培养板小鼠解剖台板或平 1111；无菌眼科剪丿J、锻子各数把；大银子一个；止血钳两个一次性5沁注射器2套二、 实验方法2.1将Balb/c小鼠拉颈脱臼处死，浸泡于75%酒梢5分钟，随即放入超净工作台内，腹部 朝上放于平皿内或固定于解剖板上2用眼科银了夹起小鼠腹部皮肤，用剪刀剪一小口，注意切勿剪破腹膜，以免腹腔液外 流然后用剪刀向上下两侧做钝性分离，充分暴露腹膜用酒精棉球擦拭腹膜消毒3用注射器吸取5ml RPMI 1640基础培养液，注入小鼠腹腔,注射器停留不动,晃动小鼠 或反复抽吸儿次用原注射器抽回腹腔内液体，注入离心管如此反复操作3〜4次2. 4 lOOOrpm 离心 lOmin,弃上清2.5用20〜50ml完全培养液重悬细胞，100卩1/孔滴加到培养板，置培养箱备用2.6观察饲养细胞的生长状态，一般隹长良好的饲养细胞和巨嗜细胞呈梭形或多角形、细 胞透亮、折光性强第三章细胞融合细胞融合是人工定向制造新细胞品系的重要手段，也是制造单克降细胞系的关键技术。

在 保证有良好的亲本细胞、稳定和良好的培养体系的条件下，细胞融合的成败和融合率则取 决于融合剂和操作技巧细胞融合的助融剂和助融手段主要有三种；生物学方法：用仙台病毒或鸡新城疫病毒作助融剂物理学方法：用电融合仪发出的脉冲电流使相邻的两细胞穿孔而融合化学方法：川聚乙二醇或血卵磷脂作助融剂PEG作助融剂是比较方便简单的操作方法，貝体方法如下：一、 实验材料1.1眼科银子、剪刀数把、固定板37°C温水1.3酒精灯、离心管架、离心管、离心机、5-1 Oml吸管、1ml吸管、滴管、计数池、平皿 数个二、 实验试剂2. 1 融合剂:50%PEG W=3000PEG3000 lgRPMT1640 1ml 8T0 磅火菌2.2基础培养液（RPMI1640）RPM11640 —包（10. 4g）I-G （【厂谷氨酰胺）0. 3gHEPES 3.0g碳酸盘钠3. 0g庆大每素一支三蒸水加至1000ml2.3 1640完全培养液（10%）基础培养液 180ml胎牛血清 20ml2.4 HT 培养液（终浓度 H 为 1X 10_4M, T 为 1.6X10_5M）基础培养液197.5mlHT 浓缩液（100X） 2.5ml胎牛血清 50ml-次融合约配250亳升2.5 HAT培养液（终浓度A为4X10-7M）基础培养液197.5mlHAT 浓缩液（100X） 2. 5ml胎牛血清50ml2.6细胞冻存液1640完全培养液70mlDMSO 10ml胎牛血清 20ml2. 7 3%醋酸溶液30% 乙酸 10mldII20 90ml三、实验步骤3.1脾细胞制备：取加强免疫小鼠一只，眼眶采血示脱臼处死，在75%洒精中消毒后取脾脏, 去除结缔组织，制备脾细胞悬液,转移到50ml离心管中，加RPM11640至30ml, 1500-2000rpm 离心5分钟,弃上清,加RPMT1640至30ml,白细胞稀释液稀释20倍，计数,取IX 10*个 细胞待用。

3.2骨髓瘤细胞制备：取3瓶生长状态良好的（活细胞数＞95%）骨髓瘤细胞,将之完全吹 下，转移到50ml离心管中,加RPMT1640至30ml, 1500~2000rpm离心5分钟,弃上清,加 RPMI1640至30ml, RPM11640稀释10倍，计数,取2X10?个细胞待用3. 3细胞混合：脾细胞:骨髓瘤=5： 1,混合,1500-2000rpm离心5分钟注意：由于细胞融合是个随机过程，母细胞比例不一，会影响融合产物；或是两种母细胞 融合而成的杂交细胞，或是一种细胞H身融合产物多数实验者采用骨髓麴细胞：脾细胞 =1： 5,也冇人采取其他比例，如骨髓瘤细胞：脾细胞=1： 5,甚至是1： 1减少脾细胞 用量目的是降低脾细胞自身融合的机率3.4细胞融合：将离心上清倒干，把沉淀细胞块弹成糊状，置37°C水浴，在1分钟内加入 lml融合剂,并搅拌细胞,37°C水浴放置45秒,在1分钟内加入lml 1640并搅拌细胞2分钟内加入5ml 1640并搅拌细胞终止融合剂的融合作丿山500rpm离心7分钟，弃上 清2分钟内加入10ml 1640并搅拌细胞2分钟内加入10ml 1640并搅拌细胞 3.5细胞培养：轻轻将细胞弹匀，缓缓加入HAT培养液至所需体积，将细胞重悬，轻轻地 将之混匀，加到预先准备好的饲养细胞板中。

10ml吸管滴加1滴（配弘1/板），排枪滴 加80^100微升（配10ml/板）,37°C, CO2培养箱培养、观察3.6细胞培养、换液：细胞融合后笫-吠开始，对细胞进行仔细观察，记录好细胞的牛长 状态、每孔杂交细胞瘤个数、块数、培养液有无污染、饲养细胞的状况培养3〜5天HAT 培养液换液一次，10天换HT培养液培养金20天，换1640完全培养液四. HAT选择培养液的作用在细胞融合时，可以出现：脾细胞与骨髓瘤细胞的触合，脾细胞之间的触合，骨髓瘤之间 融合，此外还有人量的未融合细胞如何除去大量未融合及H身融合的细胞呢？下面简介 HAT液作用谷氨酰胺（L-Glutaniino）,尿核苻单磷酸都是正常细胞及肿瘤细胞用来合成DNA的重要成 分（主要途径），但是这条途径可以被氨基喋吟（Aminopterin）切断另外还有-•条应急 途径即细胞内的HGPRT （次黄卩票吟-鸟卩票吟-磷酸核糖转化酶）利用（H）和TK （胸腺n密碇激 酶）利用（T）合成DNA骨髓瘤细胞株是经过8-偶氮鸟嚓吟筛选出来的，不含I1GPRT,因此不能借川应急途径合成 DNA,只能靠主要途径合成DNAo骨髓瘤细胞在HAT液中，因缺少HGPRT和TK,不能利用H - T 合成DNA,主要途径又被氨基喋吟阻断，因此细胞死亡。

免疫鼠脾细胞，虽含有HGPRT但不 适应体外培养，一般十天左右口然灭亡杂交细胞，在融合时脾细胞的HGPRT被带入，通 过应急途径利用H・T合成DNA,并继承骨髓瘤细胞体外繁殖的特性，所以能存活般融合后常用含20%胎牛血清培养液，通过筛选，亚克隆选出有-关杂交细胞后，则可换成 含10%胎牛血清培养液对已确定的杂交瘤株，则可换成含5%胎牛血清的培养液培养第四章筛选分泌抗体的杂交瘤细胞融合后当杂交细胞集落生长到一定大小，培养液开始变黄，便可开始筛选抗体活性许多方法都可以用來筛选，但应注意到筛选单克隆抗体时的一些特点；首先，培养上清中 的抗体含量低于高效抗血清的抗体含量其次，与普通抗血清不同，单克隆抗体不能多价 地识别抗原所以用来筛选单克降抗体的方法应照顾到单克降抗体的特点，而「L要准确、 迅速和方便此外应根据所需耍抗体的特点，选择不同类型的方法一般常用的冇：免疫荧光、放射免疫（RIA）、组织化学法和酶联免疫分析（ELISA）法等 最经常用方法是ELISA法在收集上清时，应在上次换液示3-4天进行，以便抗体积累上清可不经稀释或1： 5~1： 10稀释后再测抗体活性，用稀釋抗体进行筛选吋可以筛掉弱阳 性的抗体，也可以去掉因高本底所造成的假阳性。

融介后第一次筛选出的阳性克隆可能因阴性克隆或其他阳性克隆的过度生氏而丢失，故应 尽早亚克隆第一次筛选示也可能没筛选到阳性抗体，这可能由于分泌阳性抗体的细胞为数训少，应重 复测定活性2-3次现将ELISA法检测杂交瘤细胞抗体的方法介绍如下：（一）实验试剂1•磷酸盐缓冲液（PBS） （10X浓缩）氯化钠（NaCl）50g氯化钾(KC1)1.25g磷酸二氢钾(K112P04)1.25g磷酸氢二钠(Na 2 HP04・12H20)18. lg蒸憎水加至1000ml用 IM HCL 调 pH 至 7. 2封闭液2.収浓H2S04 27. 62ml,缓缓加入到473ml的蒸僻水中，混匀即可注意在加入硫酸的过程中，不要加得太快，以免过热7.抗原包被液(0. 1M碳酸盐缓冲液)pH 9.6碳酸钠(Na2C03)1.59g碳酸氢钠（N&HCO3）2. 93g叠氮钠（NaN3）0. 2g蒸镉水加至1000ml8.辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠IgG （已商品化）二）实验步骤抗原包被：纯抗原浓度一般为1-2口 g/nil,用包被液稀释后取100y 1加入聚苯乙烯酶联 检测板各孔中，4°C过夜后，洗液洗涤3次建议4°C包被过夜封闭：每孔加200 口1或加满封闭液，4°C过夜或37°C两小时后，洗涤3次，扌|'|干。