微生物学与免疫学：实验一 免疫学实验.ppt

实验内容l一、凝集试验人类ABO血型鉴定l二、沉淀试验双向扩散l三、普通光学显微镜（油镜）的使用和维护l四、大小吞噬试验l五、E花环试验l六、淋转试验一、经典的血清学反应凝集反应 凝集反应颗粒性抗原（细菌和红细胞等），当与相应抗体特异结合后，在适量电解质存在的条件下，可逐渐聚集，出现肉眼可见的凝集现象称为凝集反应 玻片凝集反应：定性试验，常用于已知抗体来鉴定未知抗原 试管凝集反应：定性和半定量试验，常用于已知抗原来检测血清中的相应的特异抗体及其含量颗粒性抗原抗体可见的凝集块直接凝集反应 ABO血型系统是人类最常见和最重要的血型系统，含A、B、H抗原根据红细胞表面所含抗原命名，红细胞膜上含A抗原者为A型血；含B抗原者为B型血；同时含A、B抗原者为AB型血；不含A及B抗原者为O型血 玻片凝集反应ABO血型鉴定(学生操作）实验步骤1先用碘酒，再用酒精消毒手指，待酒精干后用一次性采血针扎手指2采血，取一大滴血滴加到0.5ml的生理盐水中，混匀制成红细胞悬液3滴加一滴抗A，抗B到干净的玻片上4用毛细吸管滴加一滴血悬液到抗A和抗B中5边轻摇边观察有无凝集的小血块出现，有记作（），呈均匀浑浊，无凝集血块，测为阴性，记作（）。

抗A抗B血型鉴定结果A型B型AB型O型中国人的血型比例A型血型：28%，B型血型：24%，O型血型：41%，AB型血型：7%型血人l性格稳重、办事有分寸、富于正义感美中不足的是有时性情急躁，处理事务犹豫根据统计欧美人的血型为型居多一般普遍性而言，型血人皆具有强烈的自信心意志坚决，同时兼有罗曼蒂克和重视现实的双重性格，但经常一遇到麻烦，他是可冲动去解决而不会后悔自己的所作所为型血人l平静、认真、耐心、心地善良、多愁善感有时他们也固执，精神紧张东西方人最大的差别在于型血人的多少，亚洲型人数位居全球人之冠型血人淡泊，乐天，乍看时让人觉得冷漠且不太有礼貌，其实型人向来大而化之，不注重交际手腕，属于个性爽朗、开门见山型他对人有恳切，有深深的人情味，非常喜欢热闹型血人自我肯定意识很强，所以常常喜欢推翻别人的意见，虽然他往往是并无恶意型人l领袖欲高，擅争斗、有能力达到既定的目标，他们坚信自己的力量，在感到强烈嫉妒和过分自负时极易冲动而不能自制自杀概率较高 在统计上：德、日民族的血型以型人居多型者一般都具有双重性格，一方面心思细密，极力压抑自己，不伤害别人，积极服务别人；但另一方面又无法信任别人型血人非常注意修饰外观，对新事物最感兴趣关心和敏感，所以说总是站立在时代尖端上。

交友上，型血，一旦成为你的知心朋友，就会对你特别照顾和讲信用 型人为数极少，科研人员知之不详他们的性格还是个未解之谜一般来说型兼具有和型人的气质特征，秘以在气质方面不统一，缺少一贯性，也就是在性格方面充满矛盾，易怒、烦躁但他对事物皆有客观的看法，凡事要求合理化型人经常擅于讥讽，多喜欢交际活动，但也厌恶攀附权贵式的合理化型人内心对人的喜恶表现得很强烈，却绝不会形之于色二、经典的血清学反应沉淀反应 沉淀反应（precipitation）一种血清学反应可溶性抗原与相应抗体结合，在有适量电介质存在下，经过一定时间，形成肉眼可见的沉淀物沉淀反应的抗原可以是多糖、蛋白质、类脂等 沉淀反应的实验方法大体可分为环状法、絮状法、琼脂扩散法三种基本类型 l环状沉淀反应 主要用于抗原的定性试验如炭疽的诊断（Ascoli氏试验）l絮状沉淀反应 如诊断梅毒的康氏反应l琼脂扩散试验 利用可溶性抗原与抗体在半固体琼脂内进行扩散，若抗原与抗体对应，并且比例适当，就会出现白色沉淀线 可分为单向琼脂扩散反应和双向琼脂扩散反应双向琼脂扩散试验双向琼脂扩散反应（学生操作）1琼脂平板的制备：取已溶化的盐水琼脂10ml倾注于直径6cm的平板。

待琼脂凝固后，用打孔器按下图 打孔2加样：于中央孔加入AFP抗体，2、5 孔加入待测的样品，第1,4孔加AFP抗原作阳性对照，第3、6孔加入生理盐水作对照用移液器加样，均为50微升3将平板放入置37温箱中，24 小时后取出观察结果1,4:阳性对照3,6：阴性7：AFP抗体2,5：待检血清注意事项1 加样时不要将琼脂划破，以免影响沉淀线的形成2 反应时间要适宜，时间过长，沉淀线可解离而导致假阴性、不出现或不清楚三、油镜的使用及细菌形态的观察（一）显微镜的构造机械部分： 镜座、镜筒、物镜转换器、载物台、推动器、粗动螺旋、 微动螺旋等光学部分：聚光器、物镜、目镜数值孔径 也叫做镜口率（或开口率），简写为N.A，它与显微镜的分辨力成正比，与焦深成反比，与镜象亮度的平方根成正比N.A=n.sin 2n物镜与标本之间的介质析射率物镜的镜口角：指从物镜光轴上的物点发出的光线与物镜前透镜有效直径的边缘所张的角度 空气为1.0，水为1.33，玻璃为1.5，甘油为1.47，香柏油为1.52分辨力D=/2N.A.可见光的波长为0.40.7微米，平均波长为0.55微米1）减低波长；（2）增大折射率；（3）加大镜口角来提高分辨力。

二）油镜观察 使用油镜按下列步骤操作：1、在低倍镜下选好视野后，调至视野中心，用油镜观察先用粗调节旋钮将镜筒提升（或将载物台下降）约2cm，并将高倍镜转出2、在玻片标本的镜检部位滴上一滴香柏油3、从侧面注视，用粗调节旋钮将载物台缓缓地上升，（或镜筒下降），使油浸物镜浸入香柏油中，使镜头几乎与标本接触4、从接目镜内观察，上调聚光器，使光线充分照明用粗调节旋钮将载物台徐徐下降（或镜筒上升），当出现物像一闪后改用细调节旋钮调至最清晰为止如油镜已离开油面而仍未见到物象，必须再从侧面观察，重复上述操作5、观察完毕上升镜筒转动物镜转换器，使油镜物镜偏位用干净擦镜纸沾二甲苯擦去镜头上的油迹，最后再用擦镜纸擦去残留在镜头上的二甲苯（注意向一个方向擦拭） 6、将显微镜各部分还原，放回箱中 四、免疫细胞及其功能测定 淋转试验（标本片观察） T 细胞在体外培养时，受到非特异性有丝分裂原(如PHA、ConA)或特异性抗原刺激后，可出现代谢旺盛、蛋白质和核酸合成增加、细胞体积增大并能进行分裂的淋巴母细胞，此称为淋巴细胞转化现象 淋巴细胞转化率的高低，可以反映机体的细胞免疫水平，因此，可作为测定机体免疫功能的指标之一。

正常值6080淋转试验1-正在分离Tcell2-淋巴母细胞；3-过渡型4-静止TcellE花环形成试验(标本片观察） 人的T淋巴细胞膜表面有绵羊红细胞的受体（称为E受体）在一定的实验条件下，T细胞能与SRBC结合，经染色后，显微镜下可见由红色的SRBC围绕紫色的T细胞形成的细胞团，形似玫瑰花环，称为E花环 在室温与数分钟内形成花环的T细胞，称为活性E花环形成细胞（Ea） 在4冰箱过夜后形成花环的T细胞，称为E花环形成细胞总数（Et）它反映机体血液中成熟T细胞的总数E花环形成试验 五、吞噬细胞及其功能（标本片观察）l小吞噬细胞：主要是指中性粒细胞 l大吞噬细胞：单核细胞和巨噬细胞 肝脏中的枯否细胞、肺脏中的尘细胞、神经组织中的胶质细胞 中性粒细胞小吞噬中性粒细胞细菌大吞噬鸡血红细胞巨噬细胞鸡血红细胞试验报告要求1、自己动手操作的试验l实验原理与目的l实验步骤l现象结果l讨论2、老师讲解，自己未作的实验写实验原理3、看标本片请按要求画图生物科学图芽胞营养细胞菌体特征：营养细胞直杆形，芽胞位于菌体顶端，呈鼓槌状细菌名称：破伤风梭菌放大倍数：物镜目镜染色方法：SF芽胞染色实验废品处理l用过的玻片、打孔器放入消毒缸！l装自己血液的试管（胶塞取下）和滴管（胶头取下，放回原位），采血针放入铝锅！l其他如镊子、饭盒、胶塞、装酒精和碘酒的试剂瓶、模板、移液器（枪头拔下）、双扩实验的剩下的样本（抗AFP，阳性，阴性，待检）放回自己组的红框！l关照明和电扇开关，请勿关实验室总电源！下次实验l一、普通肉汤培养基的制备l二、细菌的接种和培养l三、细菌的培养技术l四、细菌的生化反应（糖发酵、IMViC、H2S）l五、消毒与灭菌不需拿显微镜！。