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临床医学论文■直肠癌原位小鼠模型的研究进展【关键词】直肠癌人类应用小鼠模型进行肿瘤研究已有100多年历史小鼠体型小、繁殖周期 短、产仔数多、饲养容易、肿瘤生长迅速、遗传资源丰富，小鼠的基因和人类相 似达95%,以上优点决定了小鼠模型在研究人类肿瘤时有着得天独厚的优势，特 别是遗传工程小鼠和免疫缺陷小鼠的出现，进一步拓展了小鼠在人类肿瘤研究中 的应用领域本文就直肠癌原位小鼠模型(以下简称模型)的制备方法、优缺点、 适用范围作一综述1自发模型自发模型指小鼠未经任何有意识人工处理，在自然情况下产生肿瘤的模型许多近交系小鼠殆系是自发的高癌殆系吋洪凯等［1］用BubRl+/-小鼠和ApcMn/+小鼠杂交获得BubRl+/ -ApcMn/+小鼠自发产生直肠肿瘤，伴发末端结肠 和小肠肿瘤自发模型的发生特征和人类肿瘤发生很相似，其缺点是模型建立所 需吋间长，容易受饲料和饲养环境影响，不可能大量获得，所以实际应用很少2诱发模型诱发模型指化学药品、病毒、物理因素等诱导产生肿瘤的模型其中，化学 药品诱导模型最常用致癌剂早期多用芳香胺类，Z后多采用直接致癌剂亚硝胺 类化合物和间接致癌剂甲基氧化偶氮甲醇(MNM)及其类似物。

2.1直接致癌剂多采用灌肠方式诱导局部致癌，致癌剂在体内代谢活化后 与细胞中的生物大分子共价结合，引起DNA损伤及遗传密码突变，这些损伤和突 变未能修复或清除，则形成肿瘤细胞国内常用甲基硝基脈(MNNG)-2.2间接致癌剂既可口服亦可注射，纱物本身并不致癌，须经氧化脱烷基后才具有致癌作用以二甲基胖(DMH)为例，它主要在肝脏被氧化成甲基偶氮 甲醇，与B 葡萄糖醛酸结合，一部分随胆汁进入肠腔，在肠道细菌和肠黏膜上 皮的B 葡萄糖甘酸作用下，导致结直肠黏膜上皮癌变以DMH及偶氮氧甲烷(AMO)常用刘成霞等⑵应用二甲基月井连续注射于昆明小鼠皮下11周，给药 后第12周成瘤率为92.86%(13/14),肿瘤结节多分布于大肠远端和近肛门处， 结节数H由单个到数十个不等诱发模型的发生过程类似人类肿瘤，简单经济，成瘤率高，适用于直肠癌发 生发展以及肿瘤预防药物研究最近研究表明，致癌物诱发模型和基因工程模型 相比更接近临床［3］陆蝶等［4］在DMH诱导小鼠结直肠癌同吋，进行5脱氧杂 氮胞昔干预，肿瘤发生率，肿瘤数冃，肿瘤最大直径与对照组相比有统计学差异, 肿瘤组织中P27Kipl表达量降低但这种模型成瘤时间需数月，潜伏期、发生率、 瘤块数H不稳定，常伴直肠外肿瘤发生，症状出现较晚，不能满足肿瘤研究和约 物筛选的精确要求［5］。

3基因工程模型3.1转基因模型是将促进肿瘤发生、发展的基因转移到小鼠体内的模型1982 年由美国 R.D.Palmilci•实验室产生的“超级小鼠”首次证实了转基因小鼠的可行性通常采用 显微注射法将H的基因注入受精卵的雄原核，再将受精卵植入假孕小鼠体内，然 后在新生鼠中筛选出基因组中整合有ri的基因的小鼠3.2基因剔除模型是将抑制肿瘤发生、发展以及转移的基因剔除的模型H前的方法有两种：①组成型基因剔除利用同源重组法将休外培养的胚胎T细 胞(ES细胞)的Fl的基因剔除，再将ES细胞植入小鼠胚泡腔内，得到嵌合体小 鼠并筛选出由所植入ES细胞发育而来的个体②诱导型基因剔除利用同源重 组法在ES细胞中Fl的基因两侧各加一个loxP位点，培育出相关小鼠体系，并与 带有Cw基因的转基因小鼠进行交配，获得H的基因两侧同时含有loxP位点和 Cw基因的小鼠最后，在适当吋候做干扰素处理，便可实现对H的基因定吋和 定位剔除的门的Colnot等⑸采用Cre/loxP系统对主要发生小肠肿瘤的 ApcMn/4-小鼠进行外显子14敲除处理，获得主要发生末端结肠和直肠肿瘤的 ApcDcl tal4/+小鼠3.3基因替换模型是由外源DNA取代内源靶序列。

它的制备方法和基因剔 除模型相似基因工程模型具有其它模型不可比拟的优势，发生过程和人类肿瘤相一致, 可模拟部分癌前病变，口肿瘤细胞的基因变异是已知的，加以活体发光荧光成像 技术的应用，对于肿瘤的发生、发展、转移的分子机制研究，尤其在分子靶向治 疗方面显示出巨大潜力，也可用于肿瘤预防的研究［7,8］基因工程模型的缺点 是：设备及技术水平要求高，制做复杂，潜伏期长，成瘤不规则，转移率低，而 且，和自发、诱发肿瘤模型一样，常伴直肠以外部位的肿瘤发生，不能提供精确、 规则的模型H前尚不确定它可否应用于约物研究［5］4移植性模型4.1移植性模型是将肿瘤细胞移植到小鼠直肠壁建立的模型，根据供体和 受体是否同一种系分为同种和异种移植性模型1992年，Kashtan等［9］忤次将 肿瘤细胞种植于小鼠直肠黏膜下层国内，付斌等［10］将鼠6 16黑色素瘤细胞种植于C57BL6J小鼠直肠黏膜下,术后第10天肉眼见肿瘤形成,并多伴有淋巴 转移o免疫缺陷小鼠发现后,移植性模型取得巨大进展，并提供一个排除了免疫系 统干扰的研究平台，成为H前应用最广泛的模型4.2移植物的来源有癌细胞株和原发癌组织细胞株能保留源癌组织的大 多微观结构和生物学特点，性质确定，制作方便，移植前还可做冃的基因修饰或 荧光/发光标记。

但细胞株被选择性培养很多代，有的还进行了基因修饰以达到 细胞永生化等建株H的，培养环境缺乏活体癌组织的结构和细胞复杂结构，包括 炎症细胞、脉管系统和其它间质成分［8］所以，细胞株不能完全代表源癌原 发癌组织标本保留了源癌的特点，但其中许多生物学特征却是未知的4.3移植物形态有细胞悬液、组织块两种［11,12］Bal ague等［12］认为注 射肿瘤细胞悬液不能很好模拟肿瘤细胞从实体肿瘤中释放进程，并且易造成注射 点和腹腔内转移的高发生率，注射的肿瘤细胞数也影响生长也有学者［13］认为 组织块比细胞悬液的成瘤率和转移率更高，但对显微器械和操作精细程度的要求 更高，因此，原位注射细胞悬液逐渐成为半前的主流方法幽1珀竽1是从 Engclbrcth Holm Swarm (EHS)小鼠肉瘤中制成可溶性基底膜成分，作为细 胞悬浮液和组织块包裹液，有效促进移植物在宿主体内的存活和增殖，H前已广 泛应用［14,15］o4.4 种植方法有外科原位种植(Surgical orthotopic implantation, SOI) (经腹、经肛)和破坏直肠黏膜后灌注癌细胞悬液两种4.4.1刘秋珍等［16］经腹正中切口，切开直肠壁达黏膜层将直肠恶性淋巴 瘤原发灶新鲜组织块包埋，平均潜伏期为6.4 d,传至第3代起成瘤率为100%, 肝转移率为63.7%,淋巴结转移率为56.4%o直肠位于盆腔深部，且鼠类盆腔狭 窄，实际操作难度大，故经腹SOI应用较少，多采用经肛SOU Bal ague等［12］ 经肛将实体瘤组织块置于直肠黏膜下层，种植10 d后，70%成瘤，局限于肌层和 黏膜层，20 d后出现不同程度的转移。

P“ck等［11］采用显微技术直视下，由肛 外缘进针，在黏膜下层滑行7〜8mm,注射细胞悬液，也成功制造出原位模型小鼠肛门小，肠壁薄，要求精细操作笔者的经验是：①避免刺破直肠壁肌层或 黏膜层，可采用微型悬吊式扩肛器充分暴露术野并保证足够的操作空间；②细胞 悬液体积限于数微升（细胞数106〜107/L）,应选用微量注射器保证注射量精 确4.4.2破坏肠黏膜后灌注细胞悬液是近年报道的模型制作方法o Takahashi 等［⑸给予BALB/C小鼠右旋糖酹硫酸酯钠（dextran sulfate sodium, DSS）饮 食成功制造直肠炎后再经肛滴入细胞悬液，第1、2周的成瘤率分别为35%、95%, 且均为单个直肠瘤块移植性模型制作方便，周期短，相对价廉，可重复性强，能一次性提供大量 精确、成瘤部位准确、成瘤率高、潜伏期短、生长速度快的癌模型伴随着活体 化学/荧光成像技术的应用，该模型广泛应用于肿瘤的发生、发展、转移机制及 其影响因子的研究，药物研发和疗效评估等领域Kawakami等［17］设计了稳定 表达绿色荧光蛋白（GFP）的直肠癌细胞株DLD1 /GFP,将这种高表达血管内皮生 长因子（VEGF C）的细胞种植于裸鼠直肠壁。

结果显示VEGF C促进肿瘤周 囤淋巴管的生成及生长，新生成的淋巴管中发现表达GFP的癌栓，DLD1/GFP组 淋巴转移率（100%）明显高于对照荷瘤鼠组（25%） o移植性模型的缺点:不是原 发肿瘤，移植部位和肿瘤的原发部位存在差异；移植物与受体组织Z间缺乏类似 于原发肿瘤和临近组织的那种相互作用；免疫缺陷鼠类虽然存在T细胞或T、B 细胞同吋功能缺陷，但NK细胞和破坏癌细胞的巨噬细胞活力显着增强，因此不 能精确模仿人类肿瘤［8］5结语上述各类模型是直肠癌研究的重要工具，己广泛应用于直肠癌的生物学及其 预防、治疗研究H前应用的模型都不能完全模仿人类肿瘤，必须认识到模型与 人类肿瘤之间的差异随着小鼠种类的逐步丰富和基因工程等技术的日渐成熟, 建立牛物学和解剖学更接近人类直肠癌，成瘤更精确规则，方便经济的模型将有 利于直肠癌的基础和临床研究参考文献】⑴时洪凯，王毅，陈燕，等.小鼠结直肠自发肿瘤模型的建立[J]・现代生物医 学进展，2007, 7（5）: 714 717.[2] 刘成霞，张尚忠，李铁军，等•二甲基盼诱导昆明小鼠大肠癌的研究等[J].中国肿瘤生物治疗杂志,2005, 11 （5） : 63 64.[3] Corpet DE, Pierre F・ How good arc rodent mode 1s of carcinogenesis in predicting efficacy in humans? A systematic review and meta analysis of colon chemoprevention in rats, mice and men[J]・ Eur J Cancer, 2005,41（13） :1911 1922.[4] 陆喋，王霞，房静远，等.5脱氧杂氮胞昔预防二甲基月井诱发小鼠大肠癌的研究[J] •中华消化杂志，2007, 27 （5）: 307 380.[5] Jamcs E, Talmadgc, Rakesh K, ct al. Murine models to evaluate novel and conventional Therapeutic strategies for cancer[J]・ Am JPathol,2007,170 （3） :793 804.[6] Colnot S, Niwa Kawakita M, Hamard G, et al. Colorectal cancers in a new mouse model of fami 1 ial adenomatous polyposis: influence of geneticand environmental modifiers[J]・ Lab Invest, 2004,84 (12) :1619 1630.[7] 刘恩歧，北岛修司，森本正敏.实验小鼠在人类癌症研究中的应用及其进展[J].癌症，2005, 24 (2) : 249 254.[8] 0ren J, Becher, Eric C・Holland・ Genetically engineered models haveadvantages over xenografts for preclinical studies[J]. Cancer Research. 2006,66 (7) :3355 3359.[9] Kashlan H, Rabau M, Mui len JB, et al. Intra rec。