12基因工程的基本操作程序.ppt

基因的结构基因的结构1.基因的结构基因的结构（（1））原核生物基因结构原核生物基因结构编码区编码区非编码区非编码区非编码区非编码区编码区上游编码区上游编码区下游编码区下游编码蛋白质编码蛋白质调控遗传信息的表达调控遗传信息的表达（调控程序）（调控程序）…A‥‥………ATGTGCACGTAGTTA………‥‥G……T‥‥………TACACGTGCATCAAT………‥‥C…终止子终止子与与RNARNA聚合酶结合位点聚合酶结合位点启动子启动子编码区编码区编码区编码区非编码区非编码区非编码区非编码区非编码区非编码区非编码区非编码区启动子启动子终止子终止子ATGTGCACGTAGTTAATGTGCACGTAGTTATACACGTGCATCAATTACACGTGCATCAATRNARNA聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶AUGUGCACGUAGUUAAUGUGCACGUAGUUA 启动子：启动子：位于基因的首端的一段特殊的位于基因的首端的一段特殊的DNADNA片断，它是片断，它是RNARNA聚合酶识别和结合的区域，有了它才能驱动基因转录聚合酶识别和结合的区域，有了它才能驱动基因转录出出mRNAmRNA，最终获得蛋白质。

最终获得蛋白质 RNA RNA聚合酶聚合酶: :能够识别能够识别启动子上的结合位点启动子上的结合位点并与其结合并与其结合的一种蛋白质的一种蛋白质 终止子：终止子：位于基因的尾端的一段特殊的位于基因的尾端的一段特殊的DNADNA片断，它片断，它能阻碍能阻碍RNARNA聚合酶的移动，并使其从聚合酶的移动，并使其从DNADNA模板链上脱离模板链上脱离下来，使转录终止下来，使转录终止mRNA不能转录为信使不能转录为信使RNARNA，，不能不能 编码蛋白质编码蛋白质能转录相应的信使：能转录相应的信使RNARNA，能，能 编码蛋白质编码蛋白质 编码区编码区非编码区非编码区原核原核细胞细胞的的 基因基因结构结构是有是有调控调控遗传信息遗传信息表达表达作用作用的核苷酸序列包括启动子的核苷酸序列包括启动子和终止子和终止子非编码区非编码区非编码区非编码区编码区编码区编码区上游编码区上游 编码区下游编码区下游 启动子启动子终止子终止子2 2、真核生物的基因结构、真核生物的基因结构编码区编码区非编码区非编码区非编码区非编码区与与RNARNA聚合酶聚合酶结合位点结合位点内含子内含子 外显子外显子 启动子启动子终止子终止子编码区上游编码区上游 编码区下游编码区下游 ①①在细胞核内转录在细胞核内转录②②在核内将内含子切去，在核内将内含子切去，外显子彼此连接外显子彼此连接前体前体mRNAmRNA真核真核细胞细胞的的 基因基因结构结构编码区编码区非编码区非编码区外显子外显子内含子内含子：有调控作用的核苷酸序列，：有调控作用的核苷酸序列， 包括位于编码区上游和下游包括位于编码区上游和下游 的调控系列（启动子区和终的调控系列（启动子区和终 止子区）。

止子区）编码区内编码区内能够编码蛋白质的序列能够编码蛋白质的序列叫叫做外显子做外显子 编码区内编码区内不能够编码蛋白质的序不能够编码蛋白质的序列列叫做内含子叫做内含子内含子：内含子： 外显子：外显子： 原核细胞原核细胞真核细胞真核细胞不同点不同点编码区是编码区是__________的的编码区是编码区是______ ______ 与与______ ______ 间隔排间隔排列的，是列的，是_____ _____ 的的相同点相同点都由能够编码蛋白质的都由能够编码蛋白质的 ______ ______ 与具有调与具有调控作用的控作用的 ______ ______ 区组成的区组成的3 3、原核细胞与真核细胞的基因结构比较、原核细胞与真核细胞的基因结构比较思考思考？？编码相同数目氨基酸的蛋白质，原核细胞与真编码相同数目氨基酸的蛋白质，原核细胞与真核细胞基因结构一样长吗？核细胞基因结构一样长吗？一个真核基因里外显子与内含子数目一样多吗一个真核基因里外显子与内含子数目一样多吗？？连续连续外显子外显子编码区编码区非编码非编码不连续不连续内含子内含子误区警示！误区警示！非编码区非编码区非编码系列非编码系列范围及位置范围及位置相同点相同点1. 非编码区与非编码系列：非编码区与非编码系列：2.启动子、终止子与起始密码、终止密码启动子、终止子与起始密码、终止密码启动子、终止子启动子、终止子起始密码、终止密码起始密码、终止密码位位置置功功能能编码区上游和下游编码区上游和下游的调控系列的调控系列非编码区和编非编码区和编码区的内含子码区的内含子都不编码蛋白质都不编码蛋白质位于位于DNA上上，基因的非，基因的非编码区，即编码区的上编码区，即编码区的上游、下游游、下游位于位于mRNA上上，，mRNA的始端、末端的始端、末端调控调控转录的起始转录的起始、、终止终止（都不编码蛋白质）（都不编码蛋白质）决定决定翻译的起始翻译的起始（编码（编码蛋白质）、蛋白质）、终止终止（不编（不编码蛋白质）码蛋白质）一、判断题一、判断题1．原核细胞的基因结构中没有内含子，只有外显子。

．原核细胞的基因结构中没有内含子，只有外显子　　）（　　）2．基因结构中的非编码区通常是具有调控作用的．基因结构中的非编码区通常是具有调控作用的　　）（　　）3．真核细胞基因结构中的非编码序列是位于编码区．真核细胞基因结构中的非编码序列是位于编码区上游和下游的核苷酸序列　　）上游和下游的核苷酸序列　　）4．真核细胞的一个基因只能编码一种蛋白质，因此，．真核细胞的一个基因只能编码一种蛋白质，因此，它的编码序列只含有一个外显子和一个内含子它的编码序列只含有一个外显子和一个内含子 ））×××√1.1.下下 面面 关关 于于 真真 核核 生生 物物 基基 因因 的的 认认 识识 完完 全全 正正 确确 是是 一一 组组 是是 （（ ）） ①①编编码码区区能能够够转转录录为为相相应应的的信信使使RNARNA，，经经加加工工参参与与蛋白质的生物合成蛋白质的生物合成 ② ②在非编码区有在非编码区有RNARNA聚合酶结合点聚合酶结合点 ③ ③真核细胞与原核细胞基因结构完全一样真核细胞与原核细胞基因结构完全一样 ④ ④内含子不能够编码蛋白质序列内含子不能够编码蛋白质序列 A A、、①②③ ①②③ B B、、②③④ ②③④ C C、、③④① ③④① D D、、①②④①②④D二二. .选择题选择题2. 2. 在一个真核细胞基因的编码区中，有两个外显子和在一个真核细胞基因的编码区中，有两个外显子和一个内含子，测得一个外显子有一个内含子，测得一个外显子有126126个碱基，另一个外个碱基，另一个外显子有显子有180180个碱基，内含子有个碱基，内含子有3636个碱基，那么这个编码个碱基，那么这个编码区的碱基编码序列最多能编码的氨基酸个数是区的碱基编码序列最多能编码的氨基酸个数是( )( ) A.114A.114个个B.B.5757个个 C.171C.171个个D.D.5151个个D1.2 基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序1 1、目的基因的获取、目的基因的获取2 2、基因表达载体的构建、基因表达载体的构建3 3、将目的基因导入受体细胞、将目的基因导入受体细胞4 4、目的基因的检测与鉴定、目的基因的检测与鉴定基因工程基本操作的四个步骤基因工程基本操作的四个步骤供体生物细胞供体生物细胞取出取出DNADNA用限制酶剪用限制酶剪去多余部分去多余部分目的基因目的基因　　 目前被广泛提取目前被广泛提取使用的目的基因有：使用的目的基因有：苏云金杆菌抗虫基因、苏云金杆菌抗虫基因、植物抗病基因植物抗病基因（抗病（抗病毒、抗细菌毒、抗细菌) )、、人胰岛人胰岛素基因等。

素基因等一、目的基因的获取一、目的基因的获取( (一一) )、目的基因主要是、目的基因主要是____________________________________________编码蛋白质的编码蛋白质的结构基因结构基因（二）、获取目的基因的常用方法有哪些（二）、获取目的基因的常用方法有哪些? ?1 1、从基因文库中获取、从基因文库中获取2 2、利用、利用PCRPCR技术扩增技术扩增3 3、人工合成、人工合成1 1、从基因文库中获取目的基因、从基因文库中获取目的基因（（1 1））. .基因文库基因文库 将含有某种生物不同基因的许多将含有某种生物不同基因的许多DNA片断，片断，导入到受体菌的群体中，各个受体菌分别含有导入到受体菌的群体中，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库这种生物的不同基因，称为基因文库种种类类基因组文库：基因组文库：含有一种生物的含有一种生物的全部全部基因基因部分基因文库：部分基因文库：只包含了一种生物的只包含了一种生物的部分部分基因，基因，                          如：如：cDNA文库文库提取某种生物的提取某种生物的全部全部DNADNA用适当的限制酶酶切用适当的限制酶酶切一定大小的一定大小的DNADNA片段片段将将DNADNA片段与载体连接片段与载体连接重组载体重组载体基因组文库基因组文库导入受体菌中储存导入受体菌中储存（（2 2））. .基因文库的构建方法基因文库的构建方法①①基因组文库的构建基因组文库的构建某种生物的某种生物的某器官某器官或或特定发育时期特定发育时期的的mRNAmRNA单链互补单链互补DNADNA双链双链cDNAcDNA片段片段重组载体重组载体与载体连接与载体连接cDNAcDNA文库文库反（逆）转录酶反（逆）转录酶DNADNA聚合酶聚合酶导入受体菌中储存导入受体菌中储存②② cDNA文库的构建文库的构建-----反转录法：反转录法：         真核生物基因用逆转录法得到的真核生物基因用逆转录法得到的cDNA与原基因相同吗？有哪些差异？与原基因相同吗？有哪些差异？原核生物基因呢？原核生物基因呢？思考思考？？编码区编码区非编码区非编码区非编码区非编码区DNA聚合酶聚合酶剪接有关的酶剪接有关的酶RNA聚合酶聚合酶mRNA前体前体mRNA单链单链DNAcDNA逆转录酶逆转录酶转录转录剪接剪接逆转录逆转录复制复制启动子启动子启动子启动子终止子终止子基因基因不含不含非编码非编码系列系列。

即不即不含含非编码区非编码区和和内含子内含子③③基因组文库和基因组文库和cDNA文库的主要区别文库的主要区别      文库类型文库类型 cDNA文库文库    基因组文库基因组文库        文库大小文库大小基因中启动子基因中启动子基因中内含子基因中内含子        基因多少基因多少 物种间的基因交流物种间的基因交流 说明说明小小大大无无有有无无有有某种生物的部分基因某种生物的部分基因某种生物的全部基因某种生物的全部基因可以可以部分基因可以部分基因可以 基因文库的组建过程就包含基因工程的基因文库的组建过程就包含基因工程的基本操作步骤基本操作步骤从基因文库中获取目的基因从基因文库中获取目的基因的优点是操作简便，缺点是工作量大，具有的优点是操作简便，缺点是工作量大，具有一定的盲目性一定的盲目性. .基因组文库：一般针对基因组文库：一般针对原核生物原核生物的基因，因为基因少的基因，因为基因少部分基因文库：一般针对部分基因文库：一般针对真核生物的真核生物的基因，如基因，如cDNAcDNA文库文库（（3 3）构建基因文库的目的）构建基因文库的目的 怎样从基因文库中得到我们所怎样从基因文库中得到我们所需的目的基因呢需的目的基因呢? ? 便于在便于在不知道目的基因序列不知道目的基因序列的情况下，的情况下，获得所需的目的基因及保存物种的基因。

获得所需的目的基因及保存物种的基因依据：目的基因的有关信息依据：目的基因的有关信息如：根据基因的核苷酸序列如：根据基因的核苷酸序列 基因的功能基因的功能 基因在染色体上的位置基因在染色体上的位置 基因的转录产物基因的转录产物mRNAmRNA 基因翻译产物蛋白质等特性基因翻译产物蛋白质等特性（（4）从基因文库中得到目的基因的方法）从基因文库中得到目的基因的方法——直接分离法直接分离法( (鸟枪法鸟枪法) )2 2、利用、利用PCRPCR技术扩增目的基因技术扩增目的基因① ① 概念：概念：PCRPCR全称为全称为______________________________，是一项，是一项 在生物在生物________复制复制______________________的核酸合成技术的核酸合成技术 ②②原理：原理：____________________多聚酶链式反应多聚酶链式反应体外体外特定特定DNADNA片段片段DNADNA复制复制③③过程：过程：③③过程：过程：a a、、DNADNA变性变性（（90℃-95℃90℃-95℃）：）：双链双链DNADNA模板在热作用下，模板在热作用下，__________断裂，形成断裂，形成________________b b、退火、退火（（复性复性55℃-65℃55℃-65℃）：）：系统温度降低，引物与系统温度降低，引物与DNADNA模板结合，形成局部模板结合，形成局部________________。

c c、延伸、延伸（（70℃-75℃70℃-75℃）：在）：在TaqTaq酶的作用下，合成与模酶的作用下，合成与模板互补的板互补的________________ 氢键氢键单链单链DNADNA双链双链DNADNA链链d.重复重复a.b.ca.b.c步骤：步骤： 每重复每重复一次，目的基因增加一次，目的基因增加______倍倍一一④④方式：以方式：以__________方式扩增，即方式扩增，即________（（n n为扩增循为扩增循环的次数）环的次数）⑤⑤条件：条件：______________________________________________、、 ______________________________、、___________ ___________ 、、 _____________ _____________ 、前提条件、前提条件:________________:________________⑥ ⑥ 结果：结果：模板模板DNA(DNA(含目的基因含目的基因) )四种脱氧核苷酸四种脱氧核苷酸一对引物一对引物热稳定热稳定DNADNA聚合酶聚合酶指数指数2 2n n使使__________________________________________在短时间内成百万倍地扩增在短时间内成百万倍地扩增已知基因的核苷已知基因的核苷酸序列酸序列含目的基因的含目的基因的DNADNA片段片段　 1 1个个DNADNA分子进行分子进行PCRPCR扩增扩增, ,循环循环4 4次，理论上至少需要次，理论上至少需要几个几个引物引物？？2×（（2n-1））(n为循循环次数次数)（（24-1））×2=30DNA复制复制PCR技术技术场所场所原理原理条件条件解旋方式解旋方式酶酶特点特点结果结果PCR技术扩增与技术扩增与DNA复制的比较复制的比较碱基互补配对原则碱基互补配对原则碱基互补配对原则碱基互补配对原则四种脱氧核苷酸、模四种脱氧核苷酸、模板、酶、板、酶、ATP四种脱氧核苷酸、四种脱氧核苷酸、模板、酶、模板、酶、引物引物DNA在高温下变性解旋在高温下变性解旋解旋酶催化解旋解旋酶催化解旋半保留复制、半保留复制、边解旋变复制边解旋变复制半保留复制、半保留复制、全解旋再复制全解旋再复制体外复制体外复制主要在细胞核内主要在细胞核内大量的大量的DNA片段片段形成整个形成整个DNA分子分子热稳定的热稳定的DNA聚合酶聚合酶细胞内的细胞内的DNA聚合酶、聚合酶、解旋酶、解旋酶、DNA连接酶等连接酶等蛋白质的氨基蛋白质的氨基酸序列酸序列mRNAmRNA的核苷的核苷酸序列酸序列基因的核苷基因的核苷酸序列酸序列目的基因目的基因化学合成化学合成推测推测推测推测3、人工、人工化学化学合成法：合成法：         在在基因较小，核苷酸序列已知的情况基因较小，核苷酸序列已知的情况下，下，可以利用可以利用DNA合成仪人工合成合成仪人工合成 化学法化学法合成的合成的目的基目的基因含因含内内含子、含子、启动子启动子和终止和终止子子吗？吗？①①已知核苷酸序列的已知核苷酸序列的基因，基因，直接利用直接利用DNA合成仪用合成仪用化学方法合成，不需要化学方法合成，不需要模板。

模板②②已知已知mRNA的基因的基因，以，以RNA为模板，在逆转录为模板，在逆转录酶作用下人工合成（酶作用下人工合成（反反转录法转录法）③③已知氨基酸排列顺序已知氨基酸排列顺序的的基因，逆推出基因，逆推出DNA中碱中碱基顺序，然后人工合成基顺序，然后人工合成2 2、下列属于获取目的基因的方法的是、下列属于获取目的基因的方法的是( )( )①①利用利用mRNAmRNA反转录形成反转录形成 ② ②从基因组文库中提取从基因组文库中提取③③从受体细胞中提取从受体细胞中提取 ④ ④利用利用PCRPCR技术技术 ⑤⑤利用利用DNADNA转录转录 ⑥ ⑥人工合成人工合成A.①②③⑤ B.①②⑤⑥ C.①②③④ D.①②④⑥A.①②③⑤ B.①②⑤⑥ C.①②③④ D.①②④⑥1．在已知．在已知基因的核苷酸基因的核苷酸序列的情况下，获取目序列的情况下，获取目的基因的最方便方法是的基因的最方便方法是　　　　A、化学合成法、化学合成法              B、基因组文库法、基因组文库法         C、、CDNA文库法文库法           D、聚合酶链反应、聚合酶链反应3 3、、 在基因工程中，把选出的一个目的基因（共在基因工程中，把选出的一个目的基因（共10001000个脱氧核苷酸对，其中腺嘌岭脱氧核苷酸是个脱氧核苷酸对，其中腺嘌岭脱氧核苷酸是460460个）放入个）放入DNADNA扩增仪中扩增扩增仪中扩增4 4次，那么，在扩增次，那么，在扩增仪中应放入胞嘧啶脱氧核苷酸的个数是（仪中应放入胞嘧啶脱氧核苷酸的个数是（ ）个）个A. 540       B. 8100        C. 17280       D. 7560 科学家在培育抗虫棉时，经过了许多复杂的过程科学家在培育抗虫棉时，经过了许多复杂的过程和不懈的努力，才获得成功。

和不懈的努力，才获得成功 起初把苏云金芽孢杆菌的抗虫基因插入载体质粒起初把苏云金芽孢杆菌的抗虫基因插入载体质粒中，然后导入棉花的受精卵中，结果抗虫基因在棉花中，然后导入棉花的受精卵中，结果抗虫基因在棉花体内没有表达体内没有表达 然后在插入抗虫基因的质粒中插入启动子然后在插入抗虫基因的质粒中插入启动子( (抗虫抗虫基因首端基因首端) )，导入棉花受精卵，长成的棉花植株还是，导入棉花受精卵，长成的棉花植株还是没有抗虫能力科学家又在有启动子、抗虫基因的质没有抗虫能力科学家又在有启动子、抗虫基因的质粒中插入终止子粒中插入终止子( (抗虫基因末端抗虫基因末端) )，导入棉花受精卵，，导入棉花受精卵，结果成长的植株，有了抗虫能力结果成长的植株，有了抗虫能力 资资 料料:二、基因表达载体的构建二、基因表达载体的构建—基因工程的核心基因工程的核心1. 基因表达载体的组成：基因表达载体的组成：2.目的：目的：           a a、目的基因、目的基因b b、启动子、启动子c c、终止子、终止子d d、标记基因、标记基因E E、复制原点、复制原点a、使目的基因在受体细胞中、使目的基因在受体细胞中稳定存稳定存在在并并遗传遗传给子代给子代b、使目的基因能、使目的基因能表达和发挥作用表达和发挥作用（（1 1）用一定的）用一定的______________切割切割 质粒，使其出现一个切质粒，使其出现一个切 口，露出口，露出____________________。

2 2）用）用________________________切断目切断目 的基因，使其产生的基因，使其产生__________ ________________________3 3）将切下的目的基因片段插入质粒的）将切下的目的基因片段插入质粒的____________处，处， 再加入适量再加入适量______________________，形成了一个重组，形成了一个重组 DNADNA分子（重组质粒）分子（重组质粒）限制酶限制酶黏性末端黏性末端同种限制酶同种限制酶的黏性末端的黏性末端切口切口DNADNA连接酶连接酶相同相同3.3.基因表达载体的构建过程基因表达载体的构建过程3.3.基因表达载体的构建过程基因表达载体的构建过程质粒质粒DNADNA分子分子限制酶处理限制酶处理两个切口两个切口获得目的基因获得目的基因DNADNA连接酶连接酶重组重组DNADNA分子（重组质粒）分子（重组质粒）同种同种一个切口一个切口两个黏性末端两个黏性末端注意注意①①载体载体与与表达载体表达载体的区别：的区别：二者都有标记基因和复制二者都有标记基因和复制原点两部分原点两部分DNADNA片段。

表达片段表达载体在载体基础上增加了载体在载体基础上增加了目的基因目的基因、、启动子启动子、、终止终止子子三部分结构三部分结构②②目的基因不能单独进入目的基因不能单独进入受体细胞，受体细胞，必需以表达载必需以表达载体的方式携带进去体的方式携带进去常用的受体细胞：常用的受体细胞：原核生物：大肠杆菌、原核生物：大肠杆菌、 枯草杆菌枯草杆菌 、土壤农、土壤农杆菌等杆菌等真核生物：酵母菌和动、植物细胞真核生物：酵母菌和动、植物细胞目的基因进入目的基因进入__________________内，并且在内，并且在 受体细胞内维持受体细胞内维持__________和和__________的过程的过程受体细胞受体细胞稳定稳定表达表达三、将目的基因导入受体细胞三、将目的基因导入受体细胞（一）转化：（一）转化： （二）方法（二）方法将目的基因导入将目的基因导入植物细胞植物细胞将目的基因导入将目的基因导入动物细胞动物细胞将目的基因导入将目的基因导入微生物细胞微生物细胞农杆菌转化法农杆菌转化法基因枪法基因枪法花粉管通道法花粉管通道法——显微注射法显微注射法——感受态细胞法感受态细胞法（（CaCa2+2+处理法）处理法）1 1、将目的基因导入植物细胞的方法：、将目的基因导入植物细胞的方法：（（1））农杆菌转化法农杆菌转化法 ①①农杆菌特点：农杆菌特点：易感染易感染双子叶植物和裸子植物双子叶植物和裸子植物，对大多，对大多数单子叶植物没有感染能力数单子叶植物没有感染能力②②原理：原理：Ti质粒上的质粒上的T---DNA可以可以转移转移到到受体细胞，并受体细胞，并整合整合到受体细胞染色体的到受体细胞染色体的DNA上。

上适用于适用于双子叶植物双子叶植物和裸子植物和裸子植物整合整合到染到染色体色体DNA上上转移转移至至受体细受体细胞胞Ti质质粒粒目的目的基因基因构建构建表表达达载载体体侵染侵染导入导入植植物物细细胞胞整合整合植物细植物细胞染色胞染色体体DNA表达表达新新性性状状转入转入农农杆杆菌菌③③过程：过程：组组培培转基转基因植因植株株经济有效经济有效④④优点：优点：适用于适用于单子叶植物单子叶植物（（2））基因枪法基因枪法————微弹轰击法微弹轰击法特点：成本高特点：成本高胚珠花药花丝柱头花柱子房壁子房雄蕊雌蕊（（3））花粉管通道法花粉管通道法特点：简便经济特点：简便经济适用于花较大的植物适用于花较大的植物质粒质粒目的基因目的基因构构建建表达表达载体载体早期早期胚胎胚胎受精受精卵卵代孕代孕母亲母亲转基因转基因动物动物显微显微注射注射早期胚早期胚胎培养胎培养胚胎胚胎移植移植体细体细胞胞？？2、将目的基因导入将目的基因导入动物细胞动物细胞常用的方法常用的方法: :显微注射法显微注射法操作程序：操作程序：孕育孕育分娩分娩3.3.目的基因导入微生物细胞目的基因导入微生物细胞原核生物的特点原核生物的特点: :繁殖快，多为单细胞，遗传物质相对较少。

繁殖快，多为单细胞，遗传物质相对较少大肠杆菌的转化过程大肠杆菌的转化过程: :用用CaCa2+2+处理细胞处理细胞 增加细胞壁的通透性，增加细胞壁的通透性，与细胞膜无关与细胞膜无关→→ 感受态细胞感受态细胞重组重组DNADNA分子（表达载体）与感受态细胞混合分子（表达载体）与感受态细胞混合感受态细胞吸收感受态细胞吸收DNADNA分子分子生物生物种种类类植物植物细细胞胞动动物物细细胞胞微生物微生物细细胞胞常用常用方法方法农农杆菌杆菌转转化法化法 显显微注射技微注射技术术Ca2＋＋处处理法理法受体受体细细胞胞体体细细胞胞或受精卵或受精卵受精卵受精卵原核原核细细胞胞转转化化过过程程将目的基因插将目的基因插入到入到Ti质质粒的粒的T－－DNA上上→→农农杆菌杆菌→→导导入入植物植物细细胞胞→→整整合到受体合到受体细细胞胞的的DNA→→表达表达将含有目的基将含有目的基因的表达因的表达载载体体提提纯纯→→取卵取卵(受受精卵精卵)→→显显微注微注射射→→受精卵受精卵发发育育→→获获得具有得具有新性状的新性状的动动物物Ca2＋＋处处理理细细胞胞→→感受感受态细态细胞胞→→重重组组表达表达载载体与感体与感受受态细态细胞混合胞混合→→感受感受态细态细胞吸收胞吸收DNA分子分子四、目的基因的检测与鉴定四、目的基因的检测与鉴定——检查是否成功检查是否成功        从哪些方面检测基因工程所从哪些方面检测基因工程所做的转基因生物是否成功呢？做的转基因生物是否成功呢？细胞质细胞质蛋白质蛋白质翻译翻译基因基因转录转录细胞核细胞核mRNA遗传信息的表达过程：遗传信息的表达过程：生物性状生物性状检测检测鉴定鉴定直接决定直接决定（一）、检测（一）、检测1 1、检测转基因生物染色体的、检测转基因生物染色体的DNADNA上是否插入了目的基因上是否插入了目的基因（（1））方法方法: :DNADNA分子杂交分子杂交 采用一定的技术手段，将采用一定的技术手段，将两种生物两种生物的的DNADNA分子的分子的单链放在一起，如果这两个单链具有互补的碱基序列，单链放在一起，如果这两个单链具有互补的碱基序列，那么，互补的碱基序列就会结合在一起，形成那么，互补的碱基序列就会结合在一起，形成杂合双杂合双链区链区；在没有互补碱基序列的部位，仍然是两条游离；在没有互补碱基序列的部位，仍然是两条游离的单链。

的单链 基因探针基因探针，，是一段是一段带有检测标带有检测标记且序列已知的、与记且序列已知的、与目的基因互补的核酸序列目的基因互补的核酸序列　基因探针通过分子杂交与目的基因结合，产生杂交　基因探针通过分子杂交与目的基因结合，产生杂交信号，能从浩翰的基因组中把目的基因显示出来信号，能从浩翰的基因组中把目的基因显示出来 ②②.将含目的基因的将含目的基因的DNA片段用放射性同位素片段用放射性同位素等作标记等作标记,以此做探针以此做探针③③.使探针和转基因生物的基因组杂交使探针和转基因生物的基因组杂交,若显示出杂若显示出杂交带交带,表明目的基因已插入染色体表明目的基因已插入染色体DNA中中（（2）过程）过程:①①.首先取出转基因生物的首先取出转基因生物的基因组基因组DNA(核核DNA)（二）、鉴定（个体生物学水平）（二）、鉴定（个体生物学水平）2 2、检测目的基因是否转录出了、检测目的基因是否转录出了mRNAmRNA3 3、检测目的基因是否翻译成蛋白质、检测目的基因是否翻译成蛋白质抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等①①方法方法: :分子杂交分子杂交方法方法: :抗原抗体杂交抗原抗体杂交②②过程过程:       用上述探针和转基因生物的用上述探针和转基因生物的mRNA杂交，杂交，若出现杂交带，表明目的基因转录出了若出现杂交带，表明目的基因转录出了mRNA归纳步骤目的基因的检测与鉴定小结目的基因的检测与鉴定小结检测检测—鉴定鉴定——①①检测转基因生物染色体的检测转基因生物染色体的DNADNA上是上是否否插入插入了目的基因了目的基因②②检测目的基因检测目的基因是否转录是否转录出了出了mRNAmRNA③③检测目的基因检测目的基因是否翻译是否翻译成蛋白质成蛋白质抗虫、抗病、抗药性接种实验、产物活抗虫、抗病、抗药性接种实验、产物活性鉴定等性鉴定等方法方法——方法方法——方法方法——DNADNA分子杂交分子杂交分子杂交（分子杂交（注意与注意与①①不同之处不同之处））抗原抗体杂交抗原抗体杂交DNA链与链与DNA链杂交链杂交DNA链与链与RNA链杂交链杂交是否产生相应的性状是否产生相应的性状分子水平分子水平个体水平个体水平归纳: 基因工程的基本操作程序1.1.获取目的基因获取目的基因u从基因文库从基因文库u利用利用PCRPCRu化学方法人工合成化学方法人工合成2.2.构建基因表达载体构建基因表达载体u目的基因、启动子、终止子、标记基因、复制原目的基因、启动子、终止子、标记基因、复制原点点3.3.将目的基因导入受体细胞将目的基因导入受体细胞u农杆菌转化法、显微注射法、农杆菌转化法、显微注射法、CaCa2+2+处理法处理法4.4.目的基因的检测与鉴定目的基因的检测与鉴定u检测：是否插入、转录、翻译检测：是否插入、转录、翻译u鉴定：鉴定：是否产生相应的性状是否产生相应的性状基因工程的别名基因工程的别名操作环境操作环境操作对象操作对象操作水平操作水平基本过程基本过程主要的技术主要的技术结果结果最大优点最大优点DNA重组技术重组技术；；基因拼接技术基因拼接技术生物体外生物体外基因基因DNA分子水平分子水平人类需要的新生物类型人类需要的新生物类型或或产品产品剪切剪切 → → 拼接拼接 → → 导入导入→ → 表达表达DNA重组技术和转基因技术重组技术和转基因技术打破物种间的生殖隔离，实现打破物种间的生殖隔离，实现定向改造生物遗传物质定向改造生物遗传物质例例1：科学家将大麦细胞的：科学家将大麦细胞的LTP1基因植入基因植入啤酒酵母菌中，获得的啤酒酵母菌种可产啤酒酵母菌中，获得的啤酒酵母菌种可产生生LTP1蛋白，并酿出泡沫丰富的啤酒。

基蛋白，并酿出泡沫丰富的啤酒基本的操作过程如下：本的操作过程如下：抗四环素基因抗四环素基因抗青霉素基因抗青霉素基因目的基因目的基因DNA类型类型抗青霉抗青霉素基因素基因抗四环抗四环素基因素基因两两两两连接连接产物产物自我自我连接连接重组质粒重组质粒质粒质粒-质粒质粒目的目的-目的目的质粒质粒目的目的+ ++ ++ ++ ++ +——————————含青霉素青霉素的培养基含青霉素青霉素和四四环素环素的培养基菌落类型：Ø含质粒含质粒Ø含质粒含质粒-质粒质粒Ø含重组质粒含重组质粒菌落类型：Ø含质粒含质粒-质粒质粒Ø含质粒含质粒 例例2.2.（（0808江江苏苏）将）将动动物致病菌的抗原基因物致病菌的抗原基因导导入入马铃马铃薯制薯制成植物疫苗，成植物疫苗，饲饲喂喂转转基因基因马铃马铃薯可使薯可使动动物物获获得免疫力得免疫力以下是与植物疫苗制以下是与植物疫苗制备过备过程相关的程相关的图图和表请请根据以根据以下下图图表回答下列表回答下列问题问题（（1 1）在采用常）在采用常规规PCRPCR方法方法扩扩增目的基因的增目的基因的过过程中，程中，使用的使用的DNADNA聚合聚合酶酶不同于一般生物体内的不同于一般生物体内的DNADNA聚合聚合酶酶，，其最主要的特点是其最主要的特点是 。

耐高温耐高温 （（2 2））PCRPCR过过程中退火（复性）温度必程中退火（复性）温度必须须根据引物根据引物的碱基数量和种的碱基数量和种类类来来设设定表1 1为为根据模板根据模板设计设计的的两两对对引物序列，引物序列，图图2 2为为引物引物对对与模板与模板结结合示意合示意图图请请判断哪一判断哪一对对引物可采用引物可采用较较高的退火温度？高的退火温度？________________________________引物对引物对B （（3 3））图图1 1步步骤骤③③所用的所用的DNADNA连连接接酶酶对对所所连连接的接的DNADNA两端两端碱基序列是否有碱基序列是否有专专一性要求？一性要求？ 否否 （（4 4））为为将外源基因将外源基因转转入入马铃马铃薯，薯，图图1 1步步骤骤⑥⑥转转基因所基因所用的用的细细菌菌B B通常通常为为 农杆菌农杆菌 （（5 5））对对符合符合设计设计要求的重要求的重组质组质粒粒T T进进行行酶酶切，假切，假设设所用所用的的酶酶均可将均可将识别识别位点完全切开，位点完全切开，请请根据根据图图1 1中中标标示的示的酶酶切位切位点和表点和表2 2所列的所列的识别识别序列，序列，对对以下以下酶酶切切结结果作出判断。

果作出判断①①采用采用EcoRⅠEcoRⅠ和和PstⅠPstⅠ酶酶切，得到切，得到__________________种种DNADNA片断②②采用采用EcoRⅠEcoRⅠ和和SmaⅠSmaⅠ酶酶切，得到切，得到__________________种种DNADNA片断2 1 1例例3.（（13北京）斑马鱼的酶北京）斑马鱼的酶D由由17号染色体上的号染色体上的D基因基因编码具有纯合突变基因（编码具有纯合突变基因（dd）的斑马鱼胚胎会发出）的斑马鱼胚胎会发出红色荧光利用转基因技术将绿色荧光蛋白（红色荧光利用转基因技术将绿色荧光蛋白（G））基基因整合到斑因整合到斑马鱼马鱼1717号染色体上，号染色体上，带带有有G G基因的胚胎能基因的胚胎能够够发发出出绿绿色色荧荧光未整合光未整合G G基因的染色体的基因的染色体的对应对应位点表示位点表示为为g g用个体M M和和N N进进行如下行如下杂杂交交实验实验1 1）在上述）在上述转转基因基因实验实验中，将中，将G G基因与基因与质质粒重粒重组组，，需要的两需要的两类类酶酶是是 和和 。

限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶    DNA连接酶连接酶 将重将重组质组质粒粒显显微注射到斑微注射到斑马鱼马鱼 中，整合到染中，整合到染色体上的色体上的G G基因基因 后，使胚胎后，使胚胎发发出出绿绿色色荧荧光2 2）根据上述）根据上述杂杂交交实验实验推推测测：：①①亲亲代代M M的基因型是的基因型是 （（选选填填选项选项前的符号）前的符号）a. DDgg b. Ddgga. DDgg b. Ddgg②②子代中只子代中只发发出出绿绿色色荧荧光的胚胎基因型包括光的胚胎基因型包括 （（选选填填选项选项前的符号）前的符号）a. DDGG b. DDGg c. DdGG d. DdGga. DDGG b. DDGg c. DdGG d. DdGg受精卵受精卵表达表达b b b、、d d（（3 3））杂杂交后，出交后，出现红现红·绿荧绿荧光（既有光（既有红红色又有色又有绿绿色色荧荧光）胚胎的原因是光）胚胎的原因是亲亲代代 （填（填“M M”或或“N N”）的初）的初级级精（卵）母精（卵）母细细胞在减数分裂胞在减数分裂过过程中，同源染色体的程中，同源染色体的 发发生了交生了交换换，，导导致染色体上的基因重致染色体上的基因重组组。

通通过记录过记录子子代中代中红红·绿荧绿荧光胚胎数量与胚胎光胚胎数量与胚胎总总数，可数，可计计算得到算得到该亲该亲本本产产生的重生的重组组配子占其全部配子的比例，算式配子占其全部配子的比例，算式为为 N 非姐妹染色单体非姐妹染色单体 4 4××（（红红·绿荧绿荧光胚胎数量光胚胎数量/ /胚胎胚胎总总数）数）例例4.(134.(13广广东东) )地中海地中海贫贫血症属于常染色体血症属于常染色体遗传遗传病一对对夫夫妇妇生有一位重型生有一位重型ββ地中海地中海贫贫血症患儿，分析血症患儿，分析发现发现，，患儿血患儿血红红蛋白蛋白ββ链链第第3939位氨基酸的位氨基酸的编码编码序列序列发发生了突生了突变变（（C→TC→T）用PCRPCR扩扩增包含增包含该该位点的一段位点的一段DNADNA片段片段l l，，突突变变序列的序列的扩扩增片段可用一种限制增片段可用一种限制酶酶酶酶切切为为大小不同大小不同的两个片段的两个片段m m和和s s；但正常序列的；但正常序列的扩扩增片段不能被增片段不能被该该酶酶酶酶切，如切，如图图1111（（a a）。

目前患儿母）目前患儿母亲亲再次再次怀怀孕，并接受孕，并接受了了产产前基因前基因诊诊断家庭成断家庭成员员及胎儿的及胎儿的PCRPCR扩扩增增产产物物酶酶切切电电泳泳带带型示意型示意图见图图见图1111（（b b）终终止密止密码码子子为为UAAUAA、、UAGUAG、、UGAUGA（（1 1）在）在获获得得单链单链模板的方式上，模板的方式上，PCRPCR扩扩增与体内增与体内DNADNA复制不同，前者通复制不同，前者通过过____________________解开双解开双链链，后者通，后者通过过________________解开双解开双链链2 2）据）据图图分析，胎儿的基因型是分析，胎儿的基因型是______________（基因用（基因用A A、、a a表示）患儿患病可能的原因是表示）患儿患病可能的原因是________________的原始生的原始生殖殖细细胞通胞通过过______________________________过过程程产产生配子生配子时时，，发发生生了基因突了基因突变变；从基因表达水平分析，其患病是由于；从基因表达水平分析，其患病是由于__________________________________________________________________________________________________________________。

高温高温  解旋酶解旋酶 Aa 母亲母亲减数分裂减数分裂突突变变后后终终止密止密码码子提前出子提前出现现，翻，翻译译提前提前终终止形止形成异常蛋白成异常蛋白（（3 3）研究者在另一种）研究者在另一种贫贫血症的一位患者血症的一位患者ββ链链基因中基因中检测检测到一个新的突到一个新的突变变位点，位点，该该突突变导变导致致ββ链链第第102102位位的天冬的天冬酰酰胺替胺替换为苏换为苏氨酸如果氨酸如果________ ___________ ___ ____ _____ _，但，但____________________________________，，则为证则为证明明该该突突变变位点就是位点就是这这种种贫贫血症的致病位点提血症的致病位点提供了一个有力供了一个有力证证据                                                     除了第除了第102位氨基位氨基酸外，其他氨基酸都正常酸外，其他氨基酸都正常患者表现为贫血症患者表现为贫血症 例例5.5.（（1111北京）北京）T-DNAT-DNA可能随可能随机插入植物基因机插入植物基因组组内，内，导导致致被插入基因被插入基因发发生突生突变变。

用此用此方法方法诱导拟诱导拟南芥南芥产产生突生突变变体体的的过过程如下：种植野生型程如下：种植野生型拟拟南芥，待植物形成花蕾南芥，待植物形成花蕾时时，，将地上部分浸入将地上部分浸入农农杆菌（其杆菌（其中的中的T-DNAT-DNA上上带带有抗除草有抗除草剂剂基基因）因）悬悬浮液中以浮液中以实现转实现转化在适宜条件下培养，收在适宜条件下培养，收获获种种子（称子（称为为T1T1代）（（1 1））为为促促进进植株植株侧侧枝枝发发育以形成更育以形成更多的花蕾，需要去除多的花蕾，需要去除 ，因，因为为后者后者产产生的生的 会抑制会抑制侧侧芽芽的生的生长长2 2）） 为筛选为筛选出已出已转转化的个体，需化的个体，需将将T T1 1代播种在含代播种在含 的的培养基上生培养基上生长长，成熟后自交，收，成熟后自交，收获获种子（称种子（称为为T T2 2代）代）（（3 3）） 为筛选为筛选出具有抗出具有抗盐盐性状的突性状的突变变体，需将体，需将T2T2代播代播种在含种在含 的培养基上，的培养基上，获获得所需个体。

得所需个体顶芽顶芽 生长素生长素（一定浓度的）除草剂（一定浓度的）除草剂（一定浓度的）盐（一定浓度的）盐（（4 4））经过经过多代种植多代种植获获得能得能稳稳定定遗传遗传的抗的抗盐盐突突变变体为为确定抗确定抗盐盐性状是性状是否由否由单单基因突基因突变变引起，需将引起，需将该该突突变变体与体与 植株植株进进行行杂杂交，再交，再自交自交 代后代后统计统计性状分离比性状分离比5 5）若上述）若上述T-DNAT-DNA的插入造成了基的插入造成了基因功能因功能丧丧失，从失，从该该突突变变体的表体的表现现型型可以推可以推测测野生型基因的存在野生型基因的存在导导致植致植物的抗物的抗盐盐性性 6 6）根据）根据T-DNAT-DNA的已知序列，利用的已知序列，利用PCRPCR技技术术可以可以扩扩增出增出被插入的基因片段其被插入的基因片段其过过程是：提取程是：提取 植株植株的的DNADNA，用限制，用限制酶酶处处理后，再用理后，再用 将将获获得的得的DNADNA片段片段连连接成接成环环（如右（如右图图）以此）以此为为模板，从模板，从图图中中A A、、B B、、C C、、D D四种四种单链单链DNADNA片断中片断中选选取取 作作为为引物引物进进行行扩扩增，得到的片断将用于增，得到的片断将用于获获取取该该基因的全序列信息。

基因的全序列信息野生型野生型 1降低降低突变体突变体  DNA连接酶连接酶 B、、C练习练习1：：(2008理综山东卷理综山东卷)为扩大可耕地面积，为扩大可耕地面积，增加粮食产量，黄河三角洲等盐碱地的开发利增加粮食产量，黄河三角洲等盐碱地的开发利用备受关注我国科学家应用耐盐基因培育出用备受关注我国科学家应用耐盐基因培育出了耐盐水稻新品系了耐盐水稻新品系1）获得耐盐基因后，构建重组）获得耐盐基因后，构建重组DNA分子所分子所用的限制性内切酶作用于图中的用的限制性内切酶作用于图中的         处，处，DNA连接酶作用于连接酶作用于          处填“a”或或“b”））a a 练习练习1：：(2008理综山东卷理综山东卷)为扩大可耕地面积，增加粮为扩大可耕地面积，增加粮食产量，黄河三角洲等盐碱地的开发利用备受关注食产量，黄河三角洲等盐碱地的开发利用备受关注我国科学家应用耐盐基因培育出了耐盐水稻新品系我国科学家应用耐盐基因培育出了耐盐水稻新品系2）将重组）将重组DNA分子导入水稻受体细胞的常用方法分子导入水稻受体细胞的常用方法有农杆菌转化法和有农杆菌转化法和                                         法。

法3）由导入目的基因的水稻细胞培养成植株需要利用）由导入目的基因的水稻细胞培养成植株需要利用                     技术，该技术的核心是技术，该技术的核心是           和和             4）为了确定耐盐转基因水稻是否培育成功，既要用）为了确定耐盐转基因水稻是否培育成功，既要用放射性同位素标记的放射性同位素标记的                                      作探针进作探针进行分子杂交检测，又要用行分子杂交检测，又要用                                        方方法从个体水平鉴定水稻植株的耐盐性法从个体水平鉴定水稻植株的耐盐性基因枪法（花粉管通道法）基因枪法（花粉管通道法）植物组织培养植物组织培养脱分化（去分化）脱分化（去分化）再分化再分化耐盐基因（目的基因）耐盐基因（目的基因）一定浓度盐水浇灌（移栽到盐碱地中）一定浓度盐水浇灌（移栽到盐碱地中） 体验高考体验高考2. （（09安徽卷）将安徽卷）将绿绿色色荧荧光蛋白基因的片段与光蛋白基因的片段与目的基因目的基因连连接起来接起来组组成一个融合基因，再将成一个融合基因，再将该该融融合基因合基因转转入真核生物入真核生物细细胞内，表达出的蛋白胞内，表达出的蛋白质质就就会会带带有有绿绿色色荧荧光。

光绿绿色色荧荧光蛋白在光蛋白在该该研究中的主研究中的主要作用是要作用是A．追踪目的基因在．追踪目的基因在细细胞内的复制胞内的复制过过程程B．追踪目的基因插入到染色体上的位置．追踪目的基因插入到染色体上的位置C．追踪目的基因．追踪目的基因编码编码的蛋白的蛋白质质在在细细胞内的分布胞内的分布D．追踪目的基因．追踪目的基因编码编码的蛋白的蛋白质质的空的空间结间结构构 C1）以下说法正确的是）以下说法正确的是 （（ ）） A、、所所有有的的限限制制酶酶只只能能识识别别一一种种特特定定的的核核苷苷酸序列酸序列 B、质粒是基因工程中唯一的运载体、质粒是基因工程中唯一的运载体 C、、运运载载体体必必须须具具备备的的条条件件之之一一是是：：具具有有多多个限制酶切点，以便与外源基因连接个限制酶切点，以便与外源基因连接 D、基因控制的性状都能在后代表现出来、基因控制的性状都能在后代表现出来C C练习练习2）不属于质粒被选为基因运载体的理由是）不属于质粒被选为基因运载体的理由是 A、能复制、能复制 （（ ）） B、有多个限制酶切点、有多个限制酶切点 C、具有标记基因、具有标记基因 D、它是环状、它是环状DNAD D练习练习3）有关基因工程的叙述中，错误的是（）有关基因工程的叙述中，错误的是（ ）） A、、DNA连接酶将黏性末端的碱基对连接起来连接酶将黏性末端的碱基对连接起来 B、、 限制性内切酶用于目的基因的获得限制性内切酶用于目的基因的获得 C、目的基因须由运载体导入受体细胞、目的基因须由运载体导入受体细胞 D、、 人工合成目的基因不用限制性内切酶人工合成目的基因不用限制性内切酶A A练习练习4）有关基因工程的叙述正确的是）有关基因工程的叙述正确的是 （（ ）） A、限制酶只在获得目的基因时才用、限制酶只在获得目的基因时才用 B、重组质粒的形成在细胞内完成、重组质粒的形成在细胞内完成 C、质粒都可作为运载体、质粒都可作为运载体 D、、蛋蛋白白质质的的结结构构可可为为合合成成目目的的基基因因提提供供资料资料D D练习练习5））基基因因工工程程是是在在DNA分分子子水水平平上上进进行行设设计计施施工工的的。

在在基基因因操操作作的的基基本本步步骤骤中中，，不不进进行行碱基互补配对的步骤是碱基互补配对的步骤是 （（ ）） A、人工合成目的基因、人工合成目的基因 B、目的基因与运载体结合、目的基因与运载体结合 C、将目的基因导入受体细胞、将目的基因导入受体细胞 D、目的基因的检测和表达、目的基因的检测和表达C C练习练习。