钟振东尼莫地平注射液对线栓法致大鼠局灶性脑缺血再灌注模型脑组织形态学的影响研究样本.doc

资料内容仅供您学习参考，如有不当或者侵权，请联系改正或者删除尼莫地平注射液对线栓法致大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤模型脑组织形态学的影响研究钟振东【作者简介】钟振东( 1974-) , 男, 助理研究员, 在职硕士, 研究方向: 实验动物病理学, , E-mail: 【通讯作者】王红星( 1953-) , 男, 研究员, 研究方向: 实验动物学, E-mail: 许跃忠1钟浩1杨玲1李韵2王红星1·( 1.四川省医学科学院·四川省人民医院实验动物研究所, 成都610212;2.四川大学华西医院病理科, 成都610041) 【摘要】目的: 研究尼莫地平注射液对线栓法致大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤模型脑组织形态学及尼氏小体的影响方法: 应用经典的线栓法阻塞大鼠大脑中动脉(MCAO), 2h后适当抽出线栓进行再灌注脑缺血后第0h、 24h、 47h时经静脉给予尼莫地平注射液(1.0mg/kg/d), 并观察动物的神经行为学、 脑梗死比率( TTC染色法) 、 脑组织形态学和尼氏小体数量结果: 尼莫地平注射液能够明显改进MCAO模型大鼠脑缺血24h～48h时的神经功能缺失体征, 可使模型动物的脑梗死比率由18.32%降低至9.29%, 能改进脑组织形态学病变和增加海马区神经元胞浆内的尼氏小体数目。

结论: 尼莫地平注射液对脑缺血急性期严重的脑组织形态学病变有改进作用, 对神经细胞有保护作用, 进而对脑梗死后的神经功能康复有促进作用关键词】尼莫地平注射液; 脑缺血再灌注损伤模型; 脑组织形态学; 尼氏小体The Effect of Nimotop Vial on Cerebral Ischemia-Reperfusion Injury of MCAO Rat in Morphology [Abstract]Objective:to study the effects of nimotop vial on rat focal cerebric ischemia-reperfusion injury model in the sections of craniocerebral tissue morphology and Nissl's body; Method: we employed classical cerebric ischemia-reperfusion injury model of MCAO, intravenous injected nimotop vial (1.0mg/kg/d) at the time points of 0h, 24h and 47h after being cerebral ischemia, and observed the changes of model animals in praxiology, cerebral infraction ratio(by TTC staining), craniocerebral tissue morphology and the number of Nissl’s body ; Results: nimotop vial can improve the nervous afunction symptoms of MCAO rats of being cerebral ischemia in 24h to 48h, can reduce the cerebral infraction ratio from 18.32% to 9.29%, can improve the craniocerebral tissue morphology and can increase the number of Nissl’s body in the cytoplasma of hippocampus neuron; Conclusion: nimotop vial can improve the serious pathological changes of cerebral ischemia in acute stage, can protect nerve cells , and can improve the convalescence of nervous function after cerebral infraction.[Keyword]: nimotop vial; cerebral ischemia-reperfusion injury model; craniocerebral tissue morphology; Nissl's body尼莫地平注射液在临床上常见于预防和治疗动脉瘤性蛛网膜下腔出血后脑血管痉挛引起的缺血性神经损伤, 但未见其对线栓法阻塞大脑中动脉致大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤模型( MCAO) 中动物脑组织和神经细胞的保护作用的研究, 故本文较深入地研究了尼莫地平注射液对线栓法致大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤模型脑组织形态学及尼氏小体的影响, 为尼莫地平注射液的作用机制研究提供参考。

1、 材料和方法1.1试验动物 SD大鼠, SPF级, 120只, 全雄, 247±46g; 由四川省医学科学院·四川省人民医院实验动物研究所提供, 生产许可证号: SCXK( 川) -161.2尼莫地平注射液( 尼膜同, Nimodipine　Injection) 由德国拜耳医药保健股份公司(Bayer HealthCare AG)生产, 进口药品注册证号: H 0154在本试验中确定尼莫地平注射液的临床成人用量为12mg/60kg/d, 故大鼠的等效剂量为1.0mg/kg/d1.3试验试剂及工具药 红四氮唑( Red tetrazolium) : 分子式为C19H15N4CL, 上海灵锦精细化工有限公司, 批号: 05014%多聚甲醛-磷酸二氢钠/氢氧化钠溶液的配制: 称取多聚甲醛 160g、 NaH2PO4·2H2O 67.52g、 NaOH 15.44g, 加入4000ml蒸馏水, 水浴( 不超过60℃) 溶解, 不断搅拌, 仍有大量不溶解的固体; 放置过夜, 水浴( 不超过60℃) 中滴加1M的NaOH溶液, 至其中的可见物溶解为止, 溶液仍不清晰, 可取上层液使用。

1.4试验器材 鱼线( 2.5号, 直径0.26mm, 基本要求为: 直径合格、 有一定的硬度和曲度、 韧性适度; 由东洋南马银燕鱼鳔厂生产) 线栓的制备: 取2.5号、 直径0.26mm的优质浅绿色尼龙鱼线, 剪取约7cm线段, 将一端插入熔化石蜡中并迅速提起, 垂吊晾干, 让石蜡自然下滴均匀覆盖前端线身成品线栓显微镜下线头呈水滴状, 线身直径达0.28mm自此端始20mm处用白色修正液作一标记备用1.5实验方法 将大鼠分为假手术组、 模型对照组和尼莫地平注射液对照组, 每组40只动物( 因为该动物模型的死亡率较高, 故在实验之初设置较多动物) , 每组再分为两个亚组, 即TTC染色用亚组和脑组织形态学研究用亚组参考文献[1-3]方法, 腹腔注射水合氯醛将大鼠麻醉, 仰卧位固定, 术区常规消毒, 颈正中线偏右切口, 用止血钳钝性分离其下的淋巴组织及腺体用眼科直镊和弯镊分离肌肉筋膜及右侧颈总动脉( CCA) , 于近分叉处绕线; 继续分离颈外动脉( ECA) 和颈内动脉( ICA) , 于分叉处结扎ECA再沿ICA往内约4mm处小心分离翼腭动脉, 并齐分叉处结扎之; ICA近分叉处备线。

然后在距CCA分叉处3mm用眼科剪剪一小口, 在自制挑针的辅助下将拴线插入到ICA, 用眼科镊轻轻送入约10mm, 再顺势插入到20mm左右, 以有抵触感为度, 即实现对大脑中动脉的阻断(MCAO)系牢ICA及CCA远心端的备线以固定线栓滴加适量的庆大霉素稀释溶液, 逐层缝合切口并消毒术中保持肛温37±0.5℃, 术后保温至动物清醒MCA阻断2h后, 动物开始有意识, 适当抽出线栓约10mm, 剪去漏出于皮肤外的线栓, 进行再灌注假手术组动物, 仅在CCA、 ECA、 ICA及翼腭动脉处备线处理, 待给予生理盐水后去线即可给药次数为三次, 即脑缺血后第0h、 24h、 47h具体方案为: 用线栓阻断MCA成功后及缝合前, 经右侧颈总静脉或其分支给予尼莫地平注射液溶液(0.2mg/ml), 假手术组和模型对照组给予等体积生理盐水再连续给药两天, 均将动物麻醉后经舌下静脉给药给药体积均为5ml/kg•d1.6观察指标[4]( 1) 神经行为学观察 参考Longa 及Bederson 的5 分制法, 在动物麻醉清醒后第2h、 24h、 48h时进行评分分值越高, 说明动物行为障碍越严重 2) 脑梗死比率的测定 取”各组的脑TTC染色用亚组”的动物, 在脑缺血后48小时, 处死动物立即取全脑, 进行TTC染色, 测定脑指数和脑梗死比率。

3) 脑组织形态学 取”各组的脑组织形态学研究用亚组”的动物, 在脑缺血后48小时, 麻醉状态下经心脏灌流( 4%多聚甲醛) , 取右脑做病理组织学研究, 观察右侧大脑海马区的形态变化 4) 特殊染色( 尼氏小体) 上述脑组织形态学研究用组织再同时进行石蜡切片, 脱蜡, 蒸馏水洗1％甲苯胺蓝水溶液至50～60℃温箱染色20～40min; 蒸馏水稍洗; 95％乙醇迅速分化; 无水乙醇脱水, 二甲苯透明中型树胶封固, 光镜400倍下观察一个视野下的神经细胞尼氏小体数目1.7统计方法 平均值间的差异应用SPSS 10.0 for windows软件提供的单因素方差分析或非参数检验进行处理2、 结果2.1神经行为学 结果详见表1MCAO模型大鼠主要在脑缺血后2h前后出现不能完全伸展右侧前爪及向左侧转圈等典型的脑缺血神经功能缺失体征( P<0.05) , 在脑缺血48h时基本恢复正常( P<0.01) 尼莫地平注射液能够明显改进MCAO模型大鼠脑缺血24h～48h时的神经功能缺失体征( P<0.01) 表1 尼莫地平注射液对MCAO模型大鼠不同时间点时神经行为学的影响 ()组 别给药剂量(mg/kg/d)动物数( 只) 神经行为学评分( 分) 脑缺血2h脑缺血24h脑缺血48h假手术组——350.00±0.00*0.00±0.000.00±0.00模型对照组——312.37±0.911.27±0.590.36±0.15#尼莫地平注射液组1.0321.05±0.570.13±0.37##0.00±0.00##注: 与模型对照组比较, *P<0.05, **P<0.01; 与脑缺血2h比较, ＃P<0.05, ＃＃P<0.01。

2.2脑梗死比率( TTC染色) 结果详见表2MCAO模型大鼠脑缺血48h时脑梗死明显, 脑梗死比率高达18.32%( P<0.01) ; 尼莫地平注射液经静脉连续给药三次具有明显的治疗作用, 可使脑梗死比率明显降低至9.29%( P<0.05) 表2 尼莫地平注射液对MCAO模型大鼠脑梗死比率的影响 ()组 别给药剂量(mg/kg/d)动物数( 只) 脑梗死比率脑指数假手术组——190.0000±0.0000**0.0054±0.0010模型对照组——130.1832±0.11520.0058±0.0005尼莫地平注射液组1.0150.0929±0.0624*0.0061±0.0011注: 与模型对照组比较, * P<0.05, ** P<0.012.3脑组织形态学 除模型对。