分子生物学-11-2-酵母杂交等.ppt

分子生物学讲义-第六章,本节课的主要问题： 酵母双杂交和酵母单杂交的区别？ 体外蛋白质互作的研究技术有哪些？ RNAi的基本原理？,6.3 DNA/蛋白质/RNA 互作技术,6.3.2 The yeast two-hybrid system,Yeast is a living ,microscopic single-cell organism that, as it grows, converts its food (through a process known as fermentation) into alcohol and carbon dioxide. Fields和Song等首先利用酵母进行真核基因转录调控因子的研究 重要的模式生物,典型的真核转录因子， 如GAL4、GCN4、等都含有二个不同的结构域: DNA结合结构域(DNA-binding domain,BD) 识别DNA上的特异序列， 并使转录激活结构域定位于所调节的基因的上游， 转录激活结构域(transcription-activating domain,AD) 转录激活结构域配合其他成分、构成转录复合体，启动基因的转录。

单独的BD能与特定基因的启动区结合，但不能激活基因的转录，而不同转录因子的BD和AD所形成的杂合蛋白却能行使激活转录的功能 这两个结构域不但可在其连接区适当部位进行拆分并保持各自的功能,而且不同的两结构域还可进行重建并发挥转录激活作用转录因子的结构域的特征,BD X-Protein Y-Protein AD,6.3.1 酵母单杂交系统,来源：酵母单杂交系统是在双杂交系统基础上发展而来的，研究蛋白质与DNA间相互作用的实验研究系统 【注意与双杂交的区别】 应用：目前酵母单要交体系已被广泛应用于寻找与特定的目的片段相互作用的蛋白质分子,报告基因 (reporter gene),是其表达产物非常容易被鉴定的基因 常利用报告基因的表达产物来鉴定目的基因的表达，从而筛选转化体,单杂交系统的原理,在报告基因上游加入已知的DNA顺式元件（结合位点）序列或随机DNA片段，将未知蛋白基因(或cDNA文库)与DNA激活域AD构成融合基因，将两者转入酵母细胞，通过报告基因有否转录，判断蛋白质与DNA有否相互作用单杂交系统的原理,共转入酵母细胞,报告基因转录,蛋白质与DNA相互作用,报告基因,报告基因上游,未知蛋白基因,已知DNA激活域AD,未知蛋白,AD,顺式元件,顺式元件,蛋白质与DNA不相互作用,未知蛋白,AD,顺式元件,报告基因不转录,报告基因转录,结论：这个未知蛋白能与顺式元件响应,酵 母,拟南芥cDNA插入片段,P,ADH1,alcohol dehydrogenase gene 乙醇脱氢酶基因,T,ADH1,乙醇脱氢酶基因 启动子,乙醇脱氢酶基因 终止子,GAL4 AD,蛋白的相互作用，导致了报告基因（LEU2和GFP基因）的表达，LEU2的表达，使酵母可以在缺少亮氨酸的培养基上生长,LEU2,DRE,DRE,DRE,DRE,P,min,URA3,Lac Z,亮氨酸 报告基因,尿嘧啶合成酶 报告基因,基本启动子,半乳糖苷酶,干旱应答元件,转化酵母转化体,营养筛选基因,筛选基因,Page 220,6.3.2酵母双杂交系统的最基本原理,酵母双杂交就是利用了不同的转录因子的BD和AD可以拆分和重建的原理，来鉴定不同蛋白质之间是否发生相互作用的系统。

融合基因BD-X 融合基因AD-Y,X-Protein Y-Protein,酵母细胞,一个杂交 又一个杂交,Different ORFs are expressed as fusion proteins to either the GAL4 DNA-binding domain (GAL4-BD) or its activation domain (GAL4-AD). If the proteins encoded by the ORFs do not interact with each other, the fusion proteins are not brought into close proximity and there is no activation of transcription of the reporter gene containing the upstream GAL4-binding sites.,两个蛋白没有反应， 报告基因不能表达,b, If the ORFs encode proteins that interact with each other, the fusion proteins are assembled at the GAL4-binding site of the reporter gene, which leads to activation of transcription.,两个蛋白相互作用， 报告基因增强表达,酵母双杂交系统的原理-文字,将编码某一蛋白X的DNA序列与DNA结合域BD的编码序列融合形成一个杂交体， 同时将编码另一蛋白Y的DNA序列与DNA激活域AD的编码序列融合形成另一个杂交体， 然后将两个杂交体转染酵母细胞，这个酵母细胞含有一个报告基因，报告基因上游存在转录因子的结合位点， 若X和Y没有相互作用，则单独不能激活报告基因的转录；若X和Y可相互作用，则使BD和AD靠近形成一个有效的转录激活子，激活报告基因的转录。

因此，可通过检测报告基因的转录与否来研究蛋白质x和Y的相互作用 酵母双杂交系统的原理就是利用了两个结构域的拆分和重建，来鉴定蛋白质之间的相互作用的哦具体实验过程：,实验中，首先运用基因重组技术把编码已知蛋白的DNA序列连接到带有酵母转录因子BD编码区的表达载体上 导入酵母细胞中使之表达带有BD的杂蛋白，与报告基因上游的启动调控区相结合，准备作为“诱饵”捕获与已知蛋白相互作用的基因产物 此时，若将AD的DNA与待筛选的cDNA文库中不同插入片段相连接，获得“猎物”载体，转化含有“诱饵”的酵母细胞 一旦酵母细胞中表达的“诱饵”蛋白与“猎物”载体中表达的某个蛋白质发生相互作用，不同转录调控因子的AD和BD结构域就会被牵引靠拢，激活报告基因表达 分离有报告基因活性的酵母细胞，得到所需要的“猎物”载体，获得与已知蛋白相互作用的新基因,了解,Library-based yeast two-hybrid screening method.,In this strategy, two different yeast strains containing two different cDNA libraries are prepared. In one case, the ORFs are expressed as GAL4-BD fusions and in the other case, they are expressed as GAL4-AD fusions. The two yeast strains are then mated and diploids selected on deficient media. Thus, only the yeast cells expressing interacting proteins survive. The inserts from both the plasmids are then sequenced to obtain a pair of interacting genes.,含有大量BD融合 蛋白的酵母文库,含有大量AD融合 蛋白的酵母文库,开始杂交,有功能的 都显出来了,了解,酵母双杂交中常用的报告基因,LacZ reporter - Blue/White Screening HIS3 reporter - Screen on His+ media (usually need to add 3AT to increase selectivity) LEU2 reporter - Screen on Leu+ media ADE2 reporter - Screen on Ade+ media URA3 reporter - Screen on Ura+ media (尿嘧啶合成基因 ),了解,酵母双杂交系统的载体 主要有二类载体: a 含DNA -binding domain的载体; b 含DNA-activating domain的载体。

上述二类载体在构建融合基因时，测试蛋白基因与结构域基因必须在阅读框内融合融合基因在报告株中表达，其表达产物只有定位于核内才能驱动报告基因的转录 例如GAL4-bd具有核定位序列(nuclear-localization sequence)， 而GAL4-ad没有因此，在GAL4-ad氨基端或羧基端应克隆来自SV40的T-抗原的一段序列作为核定位的序列 目前研究中常用binding-domain基因有： GAL4(1-147); LexA (E coli转录抑制因子)的DNA-bd编码序列常用的activating-domain基因有： GAL4(768-881)和疱疹病毒VP16的编码序列等了解,酵母双杂交的优点,能快速获得相互作用蛋白的基因 只需单一步骤的质粒构建 在体内（而不是体外）鉴定蛋白的相互作用 弱小的、暂时的相互作用也能鉴定 能在整个时间段积聚弱小的相互作用信号,假阳性的问题,假阳性是酵母双杂交系统的最大问题 假阳性通常由以下原因造成: prey蛋白的非特异性结合，无需与诱饵蛋白结合就能诱导报告基因的转录（这是大多数假阳性的诱因）,了解,假阳性的去除,通过序列分析去除 质粒消除实验剔除假阳性 重新转化含有诱饵质粒的酵母株或不含诱饵质粒的酵母株，分析两种情况后去除假阳性 利用一个不相关的蛋白作为诱饵蛋白测试相互作用 两步或多步筛选,了解,酵母双杂交系统应用,鉴定新的蛋白与蛋白相互作用 鉴定蛋白级联底物 鉴定突变对蛋白与蛋白结合的影响 在已知的相互作用中鉴定干扰蛋白质 (反向双杂交系统),了解,酵母双杂交系统的应用,已知蛋白质之间相互作用检测： 例如，Huang等利用该系统发现，芽胞酵母细胞中的Cdc2蛋白可与细胞周期中“纺锤体关卡”有关的蛋白质Madl、Mad2、Mad3相互作用。

Gonza1er等则检测了轮状病毒中5个非结构蛋白之间的相互作用，弄清了这些蛋白在病毒复制周期中的功能了解,未知蛋白质的功能研究：,通过对某一蛋白质作缺失突变或定点突变再用此系统检阅是否还存在相互作用，可阐明其功能域或关键氨基酸；也可做成点突变库，筛选出重要位置的氨基酸 例如，Melle等用此系统，研究了胃Na+,K+-ATP酶中和亚单位相互作用功能域而Lee等则阐明了皮质激素x受体(RxR)配体结合的功能域中异源二聚体相互作用的关键氨基酸理解,了解,克隆新基因、新蛋白：,将感兴趣的蛋白质基因与BD基因构建成“诱饵”表达质粒，将某一器官或组织的cDNA文库与AD基因构建成“猎物”基因库，共转化酵母细胞，可筛到与感兴趣的蛋白质相互作用的蛋白质的cDNA序列，并可推测其蛋白质序列感兴趣的蛋白质基因,+BD基因,cDNA文库与AD基因,共转化酵母细胞,可筛到与感兴趣的蛋白质相互作用的蛋白质的cDNA序列,诱饵,猎物,理解,了解,例如，ThomSTon等以信号转导中的AMPK的催化亚单位(2)为诱饵，筛选到一个AMPK调节亚单位的异构体Wible等以钾离子通道蛋白为诱饵，克隆了一个新的钾离子通道调节蛋白KchAP。

以信号转导中的AMPK的催化亚单位(2)为诱饵,AMPK调节亚单位的异构体,筛选,钾离子通道蛋白为诱饵,筛选,新的钾离子通道调节蛋白KchAP,理解,了解,例如，ThomSTon等以信号转导中的AMPK的催化亚单位(2)为诱饵，筛选到一个AMPK调节亚单位的异构体。