构建点突变质粒步骤.doc

基因定点突变一、定点突变的目的把目的基因上面的一个碱基换成另外一个碱基二、定点突变的原理通过设计引物，并利用PCR将模板扩增出来，然后去掉模板，剩下来的就是我们的PCR产物，在PCR产物上就已经把这个点变过来了，然后再转化，筛选阳性克隆，再测序确定就行了三、引物设计原则引物设计的一般原则不再重复突变引物设计的特殊原则：（1）通常引物长度为25~45 bp，我们建议引物长度为30~35 bp一般都是以要突变的碱基为中心，加上两边的一段序列，两边长度至少为11-12 bp若两边引物太短了，很可能会造成突变实验失败，因为引物至少要11-12个bp才能与模板搭上，而这种突变PCR要求两边都能与引物搭上，所以两边最好各设至少12个bp，并且合成多一条反向互补的引物 （2）如果设定的引物长度为30 bp，接下来需要计算引物的Tm值，看是否达到78℃（GC含量应大于40%） （3）如果Tm值低于78℃，则适当改变引物的长度以使其Tm值达到78℃（GC含量应大于40%） （4）设计上下游引物时确保突变点在引物的中央位置 （5）最好使用经过纯化的引物       Tm值计算公式：Tm=0.41×(% of GC)–675/L+81.5 注：L：引物碱基数；% of GC：引物GC含量。

四、引物设计实例以GCG→ACG为例：5’-CCTCCTTCAGTATGTAGGCGACTTACTTATTGCGG-3’（1）首先设计30 bp长的上下游引物，并将A (T)设计在引物的中央位置Primer #1: 5’-CCTTCAGTATGTAGACGACTTACTTATTGC-3’ Primer #2: 5’-GCAATAAGTAAGTCGTCTACATACTGAAGG-3’精品.（2）引物GC含量为40%，L为30，将这两个数值带入Tm值计算公式，得到其Tm=75.5（Tm=0.41×40-675/30+81.5）通过计算可以看出其Tm低于78℃，这样的引物是不合适的，所以必须调整引物长度3）重新调整引物长度Primer #1: 5’-CCTCCTTCAGTATGTAGACGACTTACTTATTGCGG-3’ Primer #2: 5’-CCGCAATAAGTAAGTCGTCTACATACTGAAGGAGG-3’在引物两端加5mer（斜体下划线处），这样引物的GC含量为45.7%，L值为35，将这两个数值带入Tm值计算公式，得到其Tm为80.952（Tm=0.41×47.5-675/35+81.5），这样的引物就可以用于突变实验了。

五、突变所用聚合酶及Buffer引物和质粒都准备好后，当然就是做PCR喽，不过对于PCR的酶和buffer，不能用平时的，我们做PCR把整个质粒扩出来，延伸长度达到几个K，所以要用那些GC buffer或扩增长片段的buffer，另外，要用保真性能较好的PFU酶来扩增，防止引进新的突变除了使用基因定点突变试剂盒，如Stratagene和塞百盛的试剂盒，但价格昂贵可以使用高保真的聚合酶，如博大泰克的金牌快速taq酶、Takara的PrimeSTARTM HS DNA polymerase六、如何去掉PCR产物最简单的方法就是用DpnI酶，DpnI能够识别甲基化位点并将其酶切，我们用的模板一般都是双链超螺旋质粒，从大肠杆菌里提出来的质粒一般都被甲基化保护起来（除非你用的是甲基化缺陷型的菌株），而PCR产物都是没有甲基化的，所以DpnI酶能够特异性地切割模板（质粒）而不会影响PCR产物，从而去掉模板留下PCR产物，所以提质粒时那些菌株一定不能是甲基化缺陷株DpnI处理的时间最好长一点，最少一个小时吧，最好能有两三个小时，因为如果模板处理得不干净，哪怕只有那么一点点，模板直接在平板上长出来，就会导致实验失败。

七、如何拿到质粒直接把通过DpnI处理的PCR产物拿去做转化就行了，然后再筛选出阳性克隆，并提出质粒，拿去测序，验证突变结果八、图示精品.九、定点突变操作步骤[A] 诱导突变基因（PCR反应）以待突变的质粒为模板，用设计的引物及Muta-direct™酶进行PCR扩增反应，诱导目的基因突变1. 设计点突变引物  [注]参考引物设计指导2. 准备模板质粒DN A[注]用dam+型菌株（例如DH5α菌株）作为宿主菌在end+型菌株中常有克隆数低的现象，但是对突变效率没有影响提取质粒DNA时我们建议您使用本公司的质粒提纯试剂盒3. [选项]对照反应体系（50μl反应体系）10×Reaction Buffer5μlpUC18 control plasmid（10ng/μl，total 20ng）2μlControl primer mix（20pmol/μl）2μldNTP mixture（each 2.5mM）2μldH2O 38μlMuta-direct™ Enzyme1μl精品.4. 样品反应体系（50μl反应体系）10×Reaction Buffer5μlSample plasmid（10ng/μl，total 20ng） 2μlSample primer (F)（10pmol/μl）1μlSample primer (R)（10pmol/μl）1μldNTP mixture（each 2.5mM）2μldH2O38μlMuta-direct™ Enzyme1μl5. PCR反应条件[注]按如下参数设置PCR扩增条件。

CyclesTemperature Reaction Time1cycle95℃ 30sec15cycle95℃30sec　55℃1min　72℃1min per plasmid Kb6. PCR扩增反应完成后冰育5分钟，然后置于室温（避免反复冻融）[注] 按下列提供的PCR条件进行扩增，控制PCR循环数注意当突变点位点超过4个时会发生突变率降低的现象MutationCycles 1~2Nucleotide15cycles3Nucleotides18cycles[B] 突变质粒选择PCR反应结束后使用Mutazyme™酶消化甲基化质粒从而选择突变质粒DNA1. 准备PCR反应产物2. 加入1μl（10U/μl）Mutazyme™酶37℃温育1小时[注]当质粒DNA用量过多时Mutazyme™酶可能发生与样品反应不完全的现象因此我们建议为了保证突变率请严格遵照实验步骤进行操作如果突变率低，可以适当延长反应时间或增加Mutazyme™酶用量[C]转化反应完毕后在质粒DNA上会产生缺口，当把这个质粒DNA转入E.coli中时请选择dam+型菌株，例如DH5α精品.1. 将10μl样品加到50μl感受态细胞里，然后放置在冰上30分钟。

2. 接下来可以参照一般的转化步骤进行序列分析通常当LB平板上出白色菌落则表明发生了突变 为了证实这一结果，我们建议对白色单菌落进行测序分析如有侵权请联系告知删除，感谢你们的配合！精品。