探讨如何运用模式生物研究SCNA的功能（ X页）.doc

探讨如何运用模式生物研究SCN5A的功能第一章，背景知识利用模式生物来研究生物学问题是指利用生物进化的保守性，从一•种实验生 物得到的有关基因性质或功能方而的信息运用于其他生物往往利用一些技术上 更容易操作的生物来研究高等生物的生物学问题在分类学上，小鼠属于哺乳纲，由小家鼠演变而来它广泛分布于世界各地, 经长期人工饲养选择培育，已育成1（X）0多近交系和独立的远交群1. 成熟早，繁殖力强小鼠6〜7周龄时性成熟，雌性35〜50 口龄，妊娠 期为19〜21天；哺乳期为20〜22天;一次排卵10〜23个（视品种而定）,每胎 产仔数为8〜15头，一•年产仔胎数6〜10胎，属全年、多发情性动物，繁殖率很 高，生育期为一年2. 对外来刺激极为敏感对于多种毒索和病原体具有易感性，反应极为灵 每攵，如百万分之一的破伤风毒素能使小鼠死亡,这是其他实验动物所不能比拟的 对致癌物质也很敏感，自发性肿瘤多3. 便于提供同胎和不同品系动物可根据实验要求选择不同品系或同胎小 鼠做实验，也可选择同一品种（或品系）、同年龄、同体重、同性别的小鼠做实 验，由于动物遗传均一，个体差异小，实验结果精确可靠经长期人工饲养选择培育，已育成多达千余个独立的远交群和近交系。

由 于小鼠繁殖快，饲养管理费用低,所以成为生物医学研究小广泛使用的模式生物, 也是当今世界上研究最详尽的哺乳类实验动物小鼠胚胎干细胞的分离和基因敲 除技术的应用，更为以小鼠为对象的发育生物学研究起了推波助澜的作用2002 年8月公布了老鼠基因组物理图谱的框架随后完整的老鼠基因组图谱也完成SCN5A基因简介SCN5A基因是位于3号染色体p21-23处，编码心脏钠通道a亚单位 Nav 1.5的亚单位的基因在窦房结JL有很多跨膜电流参与心脏起搏活动的形成 Navi.5通道在窦房结电生理活动中发挥着重要的作用，心肌细胞上主要的钠通 道是NaV1.5,功能增强或者功能减弱均可导致快速/缓慢型心律失常的发生在 窦房结上，阻断钠通道可以导致起搏活动的减弱以及延缓窦房结动作电位的传 导研究还发现,SCN5A基因的突变可以导致Nav 1.5通道蛋白表达运输的障碍, 以致细胞膜上通道蛋白数量减少细胞膜JL钠通道数量，对保障细胞的快速去极 化至关重要数量的降低，会严重降低去极化的速率，导致0期去极化的幅度 减低，传导速度降低自从1995年以来，编码Ncivl.5的SCN5A中有至少170 个自然发生的突变可以引起心脏疾患，包括诸如先天性的和获得性的长QT间期 综合征，Brugada综合征，传导紊乱以及婴儿猝死综合征，病态窦房结综合征和 心房颤动以及扩张型心肌病。

这一系列的研究说明Njv1.5通道对心肌细胞动作 电位的产生和传导以及其它生理功能发挥着重要的作用因此通过对SCN5A基 因的缺失，就可能导致N“vl・5通道功能的改变，模拟出人类相应的疾病ScnSa基因敲除小鼠模型的建立及鉴定遗传病是由丁遗传物质发生改变造成的，如基因突变或者染色体畸变等基 因打靶技术是能够修饰和改造动物基因组结构并在动物的整体水平得以表现和 遗传的技术通过基因打靶途径建立的基因缺陷型的遗传小鼠模型(基因敲除小 鼠)，是研究疾病的发生机制，分子基础及诊断的主要动物模型Papadatos等利 用转基因技术开发th Scn5a基因部分敲除小鼠纯合子小鼠心室腔严重的发育性 缺陷，从而导致胚胎死亡；而杂合子(Scn5a+/-)小鼠N“vl.5通道电流减小， 可以表现为室性心动过速等心律失常Scn5a+/■小鼠心肌细胞的Navl.5通道电流较野生鼠明显减小，而通道的激 活和失活没有改变，提示存在着Nnvl.5通道表达运输的障碍，同时也观察到 Scn5a+/-小鼠可以出现缓慢型的心律失常因此，Scn5a+/-小鼠也为研究钠通道 电流减弱所致的窦房结功能障碍提供了可能的动物模型在该研究中通过对 Scn5a+/■小鼠窦房结细胞Navl.5通道电流和表达，以及窦房结等传导组织电生理 特性的研究，阐明Scn5a基因缺失导致窦房结功能障碍的机制。

基因敲除小鼠的基本程序获得FI的基因的同源片段，将此DNA片段克隆到一般的质粒载体中，从 重组质粒中切除H的基因的大部分同源DNA序列，只保留部分序列性载 体中，将带有GFP-neo基因和HSK-tk基因克隆到此线性载体中构成打靶载体通过显微注射法将打靶载体导入ES细胞，以载体上的GFP-neo基因置换 ES细胞基因上的FI的基因，从而得到丧失了 FI的基因的ES细胞基因敲除 ES细胞注射入胚泡将基因敲除的ES细胞注射入胚泡中，使其与源胚泡丛的细胞共同组成胚泡 的内细胞团胚泡植入假孕小鼠的子宫中将含有基因敲除ES细胞的胚泡移植到假孕 小鼠的子宫腔内，使ES细胞有机会发育成为小鼠或某种组织这种胚泡中既 含有基因敲除ES细胞，又含有胚泡原有的正常ES细胞，因此，这种胚泡发育 所产生的后代中有源于基因敲除ES细胞的小鼠，也有源于正常ES细胞的小 鼠嵌合体的杂交育种 对后代小鼠进行筛选，可以得到基因敲除的嵌合体小鼠 然后再经过杂交育种，按照孟德尔遗传规律，其后代中有1/4的几率为纯合子, 这样经过将嵌合体小鼠和正常小鼠进行交配，就可以得到基因敲除的纯系小鼠， 即基因敲除小鼠在获得嵌合体小鼠后需要对其进行经行鉴定，验证是否为 Scn5a+/-杂合型小鼠，采用剪去鼠尾尖，根据提取的基因组DNA进行判断。

当 替换型载体导入小鼠ES细胞，Scn5a基因的2号外显子被GFP替换，即Scn5a 基因被敲除，待ES生长成小鼠后，与野生型小鼠相互杂交，产生三种可能 Scn5a+/+, Scn5a+/-, Scn5a-/-O利用与基因组2号外显子外侧序列互补但是与载 体不互补结合的上游引物，和与2号外显子互补结合的下游引物配对，和与重 组载体互补结合的下游引物配对，PCR检测发生同源重纽的染色体，在lOOObp 和6OObp左右位置分别有两条特异性条带，提示此小鼠基因组型别为Scn5a+/-O在获得上述Scn5a+/-嵌合体小鼠后，通过分离其心肌细胞，比较嵌合体小鼠 与野生型小鼠的纳电流，Scn5a+/-小鼠心肌细胞的Navl.5通道电流较野生鼠明 显减小，而通道的激活和失活没有改变，提示存在着Navl.5通道表达运输的障 碍Scn5a基因敲除小鼠心脏传导系统功能障碍的电生理研究研究思路心肌快反应细胞（如心室肌细胞和心脏传导组织细胞）动作电位的上升支主 要由N“vl.5通道激活产生，决定着心电冲动的传导对N“vl.5通道的阻滞， 可引起心脏电活动的异常SCN5A基因的突变或缺失FI前所知可以引起6种心 脏节律紊乱的疾病：Brugada综合征，特发性心室颤动，非家族性易感性心律不 齐，心脏传导系统疾病和病态窦房结综合征。

JL述疾病主要是因为Navi.5通道 功能减弱导致Nav 1.5电流减小而Nav1.5通道G1743R突变则导致通道蛋白运输的障碍，因而细胞膜上通道蛋白数量减少，N“vl.5电流减小，产生Brugada 综合征故SCN5A基因的突变或缺失，可以通过Navi.5通道功能的改变，亦 或由于Navl・5通道蛋白运输和表达障碍，从而导致离子通道病的发生本实验 即验证上述存在的两种途径通过以上转基因动物模型，对于钠通道在窦房结起搏活动中的作用有了更进 一步的认识，同吋也可以对钠通道障碍导致的离子通道病的发病机制进行深入、 全面的研究在这个实验中通过Langendorff系统灌流Scn5a+/-小鼠离体心脏， 以排除自主神经的影响实验发现，Scn5a+/-组小鼠心率减慢，心率变异程度很 大,从150次每分钟到300次每分钟不等，且出现 房室传导阻滞而野生型 小鼠间的心率则基本在300到350次之］可且Scn5a+/-小鼠组较对照组P波吋 间及PR Di］期明显延长研究结果表明，Scn5a+A小鼠心脏传导组织电生理表现 与一些心脏传导组织疾病如病态窦房结综合征等临床表现相似因此Scn5a+/・ 小鼠可以作为研究此类疾病的良好的动物模型。

在这个研究中发现，Scn5a+/-小鼠与野生小鼠相比，窦房结细胞Nav 1.5通 道电流减少，但是激活和失活的通道功能并尢改变对Scn5a+/-小鼠与野生小鼠 窦房结区Navi.5通道蛋白表达免疫荧光检测结果显示，Scn5a+/-小鼠窦房结区 Nav 1.5通道蛋白表达降低因此，Ncivl.5通道蛋白运输和表达障碍是导致 Scn5a+/-小鼠Nav 1.5通道电流减小，产生病态窦房结综合征的主要原因对 Nav 1.5通道蛋口表达和运输障碍的干预有助于一•部分病态窦房结综合征患者的治疗这个课题应用分子牛物学，电生理的方法从细胞到转基因动物水平研究了 SCN5A基因突变和缺失导致病态窦房结征的发病机制首次发现三个SCN5A 基因突变点导致病态窦房结综合征是由于Nnvl.5通道动力学发生改变致通道 功能减弱，而不是通道蛋白质的转运障碍首次阐明Nav 1.5通道蛋白运输和表 达障碍是导致Scn5a+A小鼠Nav 1.5通道电流减小，产生病态窦房结综合征的主 要原因个人观点。