水质 用单细胞绿藻进行淡水藻类生长抑制性试验.pdf

中华人民共和国国家环境保护标准 中华人民共和国国家环境保护标准 HJ□□□-201□ 水质 用单细胞绿藻进行淡水藻类生长 抑制性试验 Water quality-Freshwater algal growth inhibition test with unicellular green algae (征求意见稿) 201□-□□-□□实施 201□-□□-□□发布 环 境 保 护 部 环 境 保 护 部 发布 目 次 前 言II 1 适用范围 1 2 规范性引用文件 1 3 术语和定义 1 4 方法原理 2 5 试剂和材料 2 6 仪器和设备 3 7 分析步骤 3 8 质量保证和质量控制 5 9 结果计算与表示 5 10 精密度 7 11 试验报告 7 附录 A（资料性附录）本标准章条编号与 BS EN ISO 8692:2004 章条编号对照 9 附录 B（资料性附录）本标准与 BS EN ISO 8692:2004 的技术性差异及其原因 10 附录 C（规范性附录）废水中绿藻生长抑制试验的快速筛选方法11 I 前 言 为贯彻《中华人民共和国环境保护法》和《中华人民共和国水污染防治法》，保护环境，保障人体 健康，规范水中生物类监测分析方法，制定本标准。

本标准规定了测定水或废水中含有的物质和混合物对单细胞绿藻生长抑制的试验方法 本标准的技术内容为等同采用《水质—用单细胞绿藻进行淡水藻类生长抑制性试验》（BS EN ISO 8692:2004）附录A给出了本标准章条编号与BS EN ISO 8692:2004章条编号的对照一览表，附录B给出 了本标准与BS EN ISO 8692:2004的技术性差异及其原因 本标准为首次发布 附录A和附录B为资料性附录，附录C为规范性附录 本标准由环境保护部科技标准司组织制订 本标准主要起草单位：广东出入境检验检疫局、环境保护部化学品登记中心 本标准环境保护部 201□年□□月□□日批准 本标准自 201□年□□月□□日起实施 本标准由环境保护部解释 II 水质 用单细胞绿藻进行淡水藻类生长抑制性试验 1 适用范围 本标准规定了测定水或废水中含有的物质和混合物对单细胞绿藻生长抑制的试验方法 本标准适用于易溶于水的物质进行单细胞绿藻生长抑制试验 本标准参照 ISO 14442 和 ISO 5667-16 进行修改后，也可适用于难溶解的有机物和无机物、挥发性化合物、重金属进 行单细胞绿藻生长抑制试验 附录 A 给出了废水中绿藻生长抑制试验的快速筛选方法。

2 规范性引用文件 本标准内容引用了下列文件中的条款 ISO 5667-16:1998 水 采 样 样 品 生 物 试 验 指 南 （ Water–Sampling–Part 16:Guidance on biotesting of samples） ISO 14442:1999 水质 用难溶性物质、挥发性化合物、金属和废水进行藻类 生长抑制试验指南（Water quality–Guidance for algal growth inhibition tests with pooly soluble materials ,volatile compounds ,metals and waste water） BS EN ISO 8692:2004 Water quality Freshwater algal growth inhibition test with unicellular green algae（水质 用单细胞绿藻进行淡水藻类生长抑制性试验） 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本标准 3.1 细胞浓度 cell density 指每单位容积培养基中的细胞数量，通常用每毫升中的细胞数表示浓度，以x表示。

3.2 比生长率 specific growth rate 指单位时间内细胞浓度的增长比率，以μ表示计算公式为： dt dx x ⋅= 1 μ 式中： μ——比生长率，d-1； x——细胞浓度，细胞数/ml； t——时间，用 d 表示 3.3 生长培养基 growth medium 混合水（5.2）和营养物质组成的培养基，绿藻细胞在其中培养生长，主要用于前期培 养和空白对照 3.4 测试样品 test sample 指水溶性样品（如废水） 、化学物质或混合物，用于测定其对海藻的生长抑制作用 3.5 1 测试培养基 test medium 由水、营养物质和测试样品混合组成 3.6 测试组 test batch 指由水、营养物质和测试样品组成的测试培养基（3.5）与海藻一起培养 3.7 对照 control 指不含测试样品，由水和营养物质组成的生长培养基（3.3）与绿藻一起培养 3.8 效应浓度 effective concentration 相对于对照，引起绿藻细胞比生长率降低 x%时的测试样品浓度建议用符号“ErCx” 表示 4 方法原理 测试样品中含有的化学物质或混合物浓度不同，会对藻类生长产生不同程度的抑制效 应。

接种处于对数生长期的单细胞绿藻细胞， 绿藻细胞在含有一定浓度测试样品的培养基 （该 培养基由混合适当量的生长培养基和测试样品组成）中培养生长几个世代培养 72h，至少 每隔 24h 测一次每个测试组中的细胞浓度 在相同的培养条件下， 测试组相对于对照组细胞 生长率的降低来表示海藻细胞生长抑制作用 5 试剂和材料 除非另有说明，分析时均使用符合国家标准的分析纯化学试剂， 5.1 试验生物：可使用以下任意一种浮游的淡水海藻物种，在海藻酸微胶囊中可保存几个 月，并且很容易从中释放出来用于进行毒性试验 5.1.1 近具刺链带藻（Desmodesmus subspicatus(86.81 SAG) 5.1.2 羊角月芽藻（Pseudokirchneriella subcapitata(Korshikov)Hindak(ATCC 22662,CCAP 278/4 或 61.81 SAG)） 注 1：这两种浮游海藻属于绿球藻目（绿藻门，绿藻纲） ，通常是单细胞培养 注 2：可以按照 5.3 和 7.1 中的培养基进行贮存培养然而需要经常进行传代培养（每周一次）以防止生 长失败贮存培养物在丰富的藻类培养基中能延长保存时间。

5.2 水：去离子水或同等纯度的水（电导率10µS/cm） ，用于制备生长培养基和溶解试验 物质 在配制和贮存过程中需要避免被无机或有机物质污染，而且不能使用铜制设备 5.3 营养物 按照表 1 配制四种溶于水的营养物贮备液 加以稀释可配制测试溶液中的最终营养物浓 度（见 7.1 和 7.4） ，也可将常量营养物质直接加入水中获得 用 0.2µm 滤膜过滤贮备液除菌，或使用高温高压灭菌（120℃，15min） 该贮备液应于 黑暗 4℃下保存 2 表 1 测试溶液中的营养物质量浓度 贮备液 营养成分 贮备液质量浓度 测试溶液中的最终营 养物质量浓度 贮备液 1：常量元素- 营养物 NH4Cl MgCl2·6H2O CaCl2·2H2O MgSO4·7H2O KH2PO4 1.5g/L 1.2g/L 1.8g/L 1.5g/L 0.16g/L 15mg/L 12mg/L 18mg/L 15mg/L 1.6mg/L 贮备液 2：Fe-EDTAFeCl3·6H2O Na2EDTA·2H2O 64mg/L 100mg/L 64µg/L 100µg/L 贮备液 3：微量元素H3BO3a MnCl2·4H2O ZnCl2 CoCl2·6H2O CuCl2·2H2O Na2MoO4·2H2O 185mg/L 415mg/L 3mg/L 1.5mg/L 0.01mg/L 7mg/L 185µg/L 415µg/L 3µg/L 1.5µg/L 0.01µg/L 7µg/L 贮备液 4：NaHCO3 NaHCO3 50g/L 50mg/L 注 а：加入 0.1mol/L 的 NaOH 可以溶解 H3BO3。

注 3：为了防止 NaHCO3的挥发损失，贮备液 4 不要进行高温高压灭菌，但可以通过膜过滤除菌 6 仪器和设备 所有接触测试培养基的设备均应由玻璃材质或其他化学惰性物质制成 6.1 温控箱或温控室：具持续均衡照明的白色荧光灯 6.2 绿藻细胞浓度测量仪：最好是粒子计数器，或显微镜和计数板测量细胞浓度最低可 达 104细胞/ml，能识别细胞生长和干扰因素（如存在颗粒物和色度） 分光光度仪具有足够 的灵敏度和足够长的光程长度（最高可达 10cm） ，可以测量 104细胞/ml然而，当细胞浓 度较低时，悬浮物质和色度会对测定产生干扰 注：如果荧光计足够灵敏度且荧光值与细胞浓度具有很好的相关性时，绿藻细胞浓度也可以使用荧光 计（例如体外用荧光测定或体内用二氯苯二甲脲（DCMU）标记后再用荧光测定）作为一种间接的方法进 行测量 6.3 培养瓶：具透气瓶塞的 250ml 锥形瓶 6.4 膜过滤器：孔径为 0.2µm 滤膜 6.5 高压灭菌锅 6.6 pH 计 6.7 一般实验室常用仪器和设备 7 分析步骤 7.1 生长培养基的制备 在约 500ml 水中加入 10ml 的贮备液 1（5.3） 、1ml 的贮备液 2（5.3） 、1ml 的贮备液 3 3 （5.3） 、1ml 的贮备液 4（5.3） ，然后用水定容至 1000ml，混匀。

该生长培养基用碳酸氢盐和充气 CO2进行缓冲 参照 ISO 14442 的规定， 通过改变 HCO3 和/或充气 CO2的浓度 （要求密闭容器） 得到不同的 pH 值 在不同的 pH 值条件下进行测试， 应记录 pH 值的更改及更改依据 注 1：如果生长培养基需要进行高温高压灭菌，那么应在灭菌后加入贮备液 4（5.3） 注 2：生长培养基应在使用前接触空气过夜平衡，或通入过滤空气鼓气 30min达到平衡后，必要时， 用 1mol/L 盐酸溶液或 1mol/L 氢氧化钠溶液调节 pH 值至 8.1±0.2 7.2 预培养和接种藻细胞 在正式测试开始前 2~4d 进行预培养试验为了在正式测试时得到处于指数生长期的藻 细胞，生长培养基（7.1）应接种较低细胞浓度（如 5×103细胞/ml~104细胞/ml 经过 3d 的预 培养） 预培养应按照与 7.6 步骤相同条件下进行 处于指数生长期的预培养藻细胞作为测试时的接种源 为了计算所需要的接种量， 在接 种前应立即测量预培养的藻细胞浓度 7.3 测试样品浓度的选择 绿藻细胞应当暴露于比率不超过 3.2 的不同测试样品浓度系列中 （如 1.0mg/L、 1.8mg/L、 3.2mg/L、5.6mg/L、10mg/L） 。

测试样品浓度应选择能够至少获得一个低于 r E Cx的抑制浓 度和一个高于 r E Cx的抑制浓度另外，为了回归分析数据，测试样品浓度应至少包含两个 处于 10%和 90%之间的抑制水平 仅用一个浓度水平来证明没有毒性的限度试验，应在限度浓度水平至少重复测定 6 次 注：通过浓度范围预试验来确定合适的浓度范围，其预试验应覆盖几个数量级的测试浓度在预试验 中不用重复测定 7.4 测试样品和贮备液的准备 根据样品性质和测试目的，如果测试样品是水溶液（如废水） ，应考虑进行前处理（如 过滤或离心） ，在样品中加入营养贮备液（5.3） ，见 7.1对于非水溶液测试样品，通常需要 准备贮备液基于测试样品的属性，仔细选择贮备液的配制方法贮备液的准备通常是将测 试样品溶于生长培养基中当测试样品不易溶于培养基中时，应进行相应的调整，详见 ISO 14442 和 ISO 5667-16 一般情况下，在加入测试样品后，试验中不用调节培养基的 pH 值但是对于一些物质 可能由于强酸或强碱性而表现出毒性作用为了测定样品的毒性不受 pH 值影响，可以使用 1mol/L 盐酸。