恶性肿瘤病人外周血免疫指标流式细胞仪检测及免疫治疗前后免疫.doc

恶性肿瘤病人外周血免疫指标流式细胞仪检测及免疫治疗前后免疫【摘要】目的 探讨应用流式细胞术(FCM)检测恶性肿 瘤病人外周血淋巴细胞多项免疫指标的变化及该指标对恶 性肿瘤免疫治疗前后的临床价值方法采用流式细胞术检 测50例恶性肿瘤病人和31例健康人的外周血CD3、CD4、CD8 等八项免疫指标变化，并且对其中10例病人应用免疫制剂 治疗前后对抗原表达的结果进行比较结果恶性肿瘤病人 免疫功能紊乱：(1)细胞免疫和体液免疫功能低下；(2)活化 T淋巴细胞明显增多(P<；0.01)； (3)接受免疫治疗的病人 治疗前后差别有统计学意义(P<；0.01)o结论用流式细胞 仪检测淋巴细胞抗原为临床观察肿瘤病人的免疫状态提供 有效的依据，免疫治疗可激活T淋巴细胞而改善免疫功能关键词】恶性肿瘤；流式细胞仪；淋巴细胞；CD；免 疫治疗[Abstract】 Objective To explore the appliestion of flow cytometry for the changes of multiple immune indexes in peripheral blood of malignant tumor patients and the clinic value of the indexes for the immunotherapy of malignant tumor・Methods F1 ow cytometry was employed for determining eight indexes， including CD3> 4、8, et. of 50 malignant tumor patients and 31 healthy persons・ Furthermore，the resuIts before and after immunotherapy of 10 patients were compared.ResuIts Immune function of malignant tumor patients is generally disordered.1.Both the cell immunity and the body fluid immunity are low2 The level of active T lymphocytes are greatly high with the control(P<；0・01)・3.For the ten cases who received immunotherapy 、 which have statistic difference compared by that before the course(P<；0.01). Conclusion Determining lymphocytes antigens by f 1 ow cytometry provides an effective basis for evaluating the immune function of tumor patients in clinic・ Immunotherapy can be active T lymphocyte so as to improve immune function.[Key words ] f 1 ow cytomet ry ； maligna nt til mor； lymphocyte ； cluster of differentiation(CD)； immunotherapy恶性肿瘤的发生、发展与机体免疫系统密切相关。

运用 流式细胞术的方法，检测T淋巴细胞表面抗原（CD3、CD4、 CD8）, B淋巴细胞表面抗原（CD19、CD20）, NK细胞表面抗原 （CD16+56）在恶性肿瘤病人外周血中的表达，并检测活化T、 B、NK淋巴细胞的免疫指标（CD3/HLA-DR. CD3/CD25）的变化, 探讨淋巴细胞在肿瘤中的表达状况及其意义，并进一步分析 恶性肿瘤病人免疫治疗前后的免疫功能改变，以致使我们更 深一层认识肿瘤在细胞水平的免疫功能1资料与方法1. 1研究对象2003年8月〜2004年5月本院肿瘤科病 房50例恶性肿瘤病人，均经病理确诊，其中肺癌23例，肝 癌6例，乳癌4例，胃癌5例，胰腺癌2例，淋巴瘤4例， 结肠癌3例，鼻咽癌1例，肾癌2例男28例，女22例， 年龄29〜65岁，平均57岁其中10例（肺癌6例，淋巴瘤 4例）年龄29〜53岁，平均41岁，经免疫增强剂（高聚生4ml 静滴，每日1次，共3个月；白介素II30万U皮下注射，每 周2次，共3个月）治疗一疗程（3个月）后，复查一次对照组31例为健康体检者，男18例，女13例，年龄36〜50岁，平均43岁，其中年龄和性别构成比与病人组差异无 显著性(P>0. 05) o1.2材料与仪器 小鼠抗人单克隆抗体CD4/CD8/CD3.CD19、CD20、CD3/CD16+56. CD3/HLA-DR、CD3/CD25 及同型 对照、红细胞裂解液(Opt订yse C)均为法国Immunotech公 司出品。

流式细胞仪(Epics XL • MCL)是美国BECKMAN COULTER公司生产1. 3研究方法使用直接免疫荧光标记全血溶血法，流式 细胞仪测定肿瘤病人外周血淋巴细胞表面抗原表达1.3. 1淋巴细胞表面标记取荧光标记单克隆抗体 CD4/CD8/CD3. CD3/CD16+56. CD3/HLA-DR、 CD3/CD25. CD19、 CD20各lOul放入试管中，分别加入外周全血1 OOul,室 温避光孵育15mino并作同型对照1.3.2溶血 加入Optilyse C 500 ul,混匀，室温避光 lOmino1.3.3洗涤 离心(1500r/min)5min,弃去上清液，加入 PBS液lml，混匀重复洗涤1次1.3.4重悬加入lml PBS,混匀，制成单细胞悬液1.3.5检测上机，每个样品检测5000个以上细胞，用 FCM软件分析，计算淋巴细胞中各标记细胞的百分率最后 所有数据应用SPSS进行统计学处理2结果对50例恶性肿瘤病人与31例健康体检者进行外周血淋 巴细胞表面抗原FCM检测，做统计学分析，结果见表1对10例肿瘤病人在免疫治疗前后淋巴细胞表面抗原和活 化T淋巴细胞抗原的表达进行了 FCM测定，发现CD4+、CD3+、 CD4/CD8 比值、CD3+/CD16+56+、CD3+/HLA-DR+、CD3-/HLA-DR+ 治疗前均较治疗后有显著性升高（（P<；0.01）,见表2。

表 1病人组与对照组淋巴细胞表面抗原及T淋巴细胞活化抗原 表达的比较（％, xs）注:与对照组相比，* P<；0. 01, ** P<；0. 05表2 10例肿瘤病人免疫治疗前后淋巴细胞表面抗原和活化T细胞抗原表达的变化(xs)注：与治疗后相比，*P<；O. 013讨论肿瘤不是一个简单的疾病过程，肿瘤免疫更是一个复杂 的过程恶性肿瘤病人往往免疫功能状态紊乱和低下，而免 疫状态在一定程度上可预示着肿瘤的发展和预后［l］o由于 肿瘤免疫过程复杂特异蛋白少，或是肿瘤细胞或蛋白样物质 掩盖了肿瘤抗原，使目前检查手段和蛋白分离方法尚不能检 出肿瘤抗原而通过实验性动物和对人类恶性肿瘤病人大量 研究表明：免疫系统的所有有效应成分均对消除肿瘤细胞、 控制肿瘤生长有作用，发挥免疫功能的淋巴细胞约占白细胞 总量的20%,可分为T、B细胞、NK细胞、巨噬细胞和树突 状细胞通常采用单克隆抗体来分析细胞表面抗原分子，并 对其分化群(簇，clusters of differentiation)进行了定 义，用CD来描述白细胞表面抗原的不同成分这样通过对 恶性肿瘤病人相应免疫指标(CD分子)的检测，可对恶性肿瘤 病人的预后进行判断并指导治疗和观察转归［5〜7］。

3. 1 T淋巴细胞及表面抗原(CD4、CD8、CD3)与肿瘤的关 系大量研究工作已证实，宿主对机体内发生的肿瘤组织有 自发性抵抗现象，而且以细胞免疫为主 M众所周知，机 体的细胞免疫由T淋巴细胞介导，T淋巴细胞的主要功能是 调节蛋白质抗原引起的所有免疫应答，并清除细胞表面抗原 或细胞内微生物的效应作用T淋巴细胞进一步分化为辅助 性T淋巴细胞(Th, CD4+/CD3+)和细胞毒性T淋巴细胞(Ts, CD8+/CD3+),对于抗原刺激的应答，辅助性T淋巴细胞分泌 细胞因子细胞因子可促进T淋巴细胞、B淋巴细胞、巨噬 细胞的增殖和分化McMichael认为［9］ T淋巴细胞作为细 胞免疫调节的中心枢纽，Th和Ts细胞之间的平衡是通过 CD4+和CD8+细胞之间的百分比表达出来的，其值下降表示免 疫状态受抑制目前研究还发现，CD4+细胞在协同杀伤肿瘤 细胞中起着重要作用［18］, CD4+细胞数减少可使肿瘤细胞 发生免疫逃逸［10, ll］o亦有学者认为机体发生肿瘤时， 在肿瘤局部的微环境发生免疫功能紊乱，表现为局部的CD8+ 亚群增高或降低，或识别肿瘤抗原上发生障碍，但恶性肿瘤 病人的免疫功能直到很晚才发生［12］。

对于大多数肿瘤细 胞来说，肿瘤细胞表达CD8+而不是CD4+, CD4+不能辨认肿 瘤细胞，而是依赖于抗原提呈细胞，如果相关的肿瘤抗原被 巨噬细胞提呈(DC),则对CD4特异性激活后才分泌淋巴因子 激活CTL细胞、巨噬细胞和B细胞，产生其他淋巴因子和淋 巴毒素和肿瘤坏死因子，肿瘤坏死因子可溶解肿瘤细胞本 文通过对50例恶性肿瘤病人和31例健康人进行外周血FCM 检测，肿瘤组CD3、CD4+/CD3+. CD4/CD8比值明显低于对照 组，肿瘤组CD8+/CD3+明显高于对照组，这表明恶性肿瘤病 人的细胞免疫明显低下(P<；0. 05或P<；0.01)o3.2B淋巴细胞及表面抗原(CD19、CD20)与肿瘤的关系 肿瘤的体液免疫是B细胞及抗体依赖的杀伤作用B细胞表 免疫球蛋白与肿瘤抗原结合，处理和递呈肿瘤抗原，从而诱 导T细胞对肿瘤的应答B细胞所产生的抗体是多克隆异源 性抗体CD20是一非免疫球蛋白产物，参与细胞激活，是B 细胞的特异性标志，前B细胞至活化B细胞时表达这一分子而CD19作为全E细胞表面标志性抗原，是B细胞活化的共 受体［13］,在B细胞活化后消失，在外周血中正常分布为 8%〜15%。

通过对CD19与CD20的检测，可在一定程度上 反映出机体体液免疫功能状态［14］本文对50例肿瘤病人 的CD19、CD20进行检测，其中恶性肿瘤病人组CD19与CD20 明显低于健康对照组(P<；0.01),表明肿瘤体液免疫也明 显受抑制，与文献报道一致［15］3.3 NK细胞及表面抗原(CD16、CD56)与肿瘤的关系NK 细胞是正常机体中对肿瘤细胞具有高度细胞毒性作用的淋 巴样细胞，是一种广谱的杀伤细胞，对阻止肿瘤生长起重要 作用NK细胞是不同于T、B淋巴细胞的淋巴细胞群，它们 在体内相对较少，它们来源于骨髓的大颗粒细胞它们不需 预先致敏即能分泌细胞毒因子，从而杀伤肿瘤细胞［16］ o 虽然NK细胞无靶细胞特异性，但在缺乏抗体和ADCC效应时, 它们表现几种水平的靶细胞选择性：首先，它们对肿瘤细胞 比对大部分正常细胞更具毒性作用；其次，不同的NK细胞 克隆对不同来源的肿瘤类群表现不同的细胞毒模式NK细胞 代表了宿主抵抗原发和转移部位肿瘤生长的第一道防线，并 通过T细胞补充特异性抗肿瘤应答在某种意义上说，NK能 强烈杀伤肿瘤细胞有研究表明，体外介导杀伤大多肿瘤细 胞的细胞亚群，90%以上是激活的NK细胞［17, 18］。

NK细 胞表面标志主要是CD16和CD56,其中CD16 一般表达于未成。