微板式化学发光酶免疫分析法临床测定人血清中孕酮.doc

微板式化学发光酶免疫分析法临床测定人血清中孕【摘要】将抗兔IgG （即二抗）物理吸附于聚苯乙烯微孔板上作 为通用固相，通过免疫反应制备固相抗体采用辣根过氧化物酶 催化鲁米诺 过氧化氢化学发光体系，建立了一种高通量、简便、 快速的化学发光酶免疫分析方法用于临床测定人血清中的孕酮 对各种影响因素如免疫试剂的稀释度、发光底物选择、发光反应 时间及温育条件等进行了考察和优化，最终选定的实验条件：孕 酮抗体和HRP标记物的最佳稀释度分别为1 : 100000和1 : 15000；选用II号发光底物，发光反应10 min后测定；37 °C水 浴条件下温育1 h对建立的方法进行了评价该方法的灵敏度 为0. 08 u g/L；批内和批间相对标准偏差均在15%之内；低、中、 高3个不同浓度值样品的平均回收率分别为101%、101%和94. 4%（在87.8%〜108%之间）使用本方法和经典的放射免疫法同时 对36份人血清样品进行测定，结果显示，木方法与放射免疫分 析方法相关性良好，其相关系数为0. 9502o【关键词】孕酮，人血清，化学发光酶免疫分析，辣根过氧化 物酶1引言孕酮(progesterone)亦称黄体酮，是天然的孕激素，由卵巢和 胎盘产生，分子量为314 D,它与雌激素共同维持女性牛殖周期 及女性生理特征［1］。

动态监测血清中的孕酮含量，有助于判定 排卵期，了解黄体功能，研究各种类固醇避孕药及抗早孕药的作 用机理［2,3］此外，近年来研究表明，孕酮的作用已远超出生 殖功能的范畴，它不仅可在神经系统中合成分泌，还能影响神经 系统的结构和功能［4］孕酮对脑损伤保护作用的实验研究及作 用机制已成为目前的研究热点之一 ［5］由于孕酮对人身心健康的重大影响，医学、生物、环境及食品安 全等各领域对该物质进行了深入研究，并建立了多种测定方法 目前孕酮的检测方法大致可以分为两类：色谱法和免疫分析法 色谱法作为检测血清中孕酮的标准方法［6, 7］,在准确性、选择 性、重现性、灵敏度等方而具有无可比拟的优势，但同时也存在 一些局限性：如仪器昂贵，操作技术要求高，需要复杂的样品前 处理等因此，在临床检测中，色谱法不能满足快速、简便、低 成本、高通量的要求而免疫分析方法具有特异性好、简便、低 成本等优点，是目前临床检测孕酮的主要方法放射免疫分析 (radioimmunoassay, RIA) ［8］ 酶联免疫分析(enzyme linked immunoadsorbent assay, ELISA)［9］、 荧光免疫分析 (fluoroimmunoassay, FIA) ［10］ > 时间分辨荧光免疫分析(timeresolved fluoroimmunoassay, TRFIA) [11]和化学发光免疫分析 (chemiluminescence immunoassay, CLIA) [12]用于人血清中孕 酮的检测都有报道。

RIA使用放射性核素，污染环境，有效期短, 测量时间长，这些缺点限制了其进一步的应用ELISA和FIA的 灵敏度较低，不利于血清中低浓度孕酮的测定TRFIA和CLIA 克服了以上方法的缺点，国外已经实现了分析技术完全自动化， 但这些进口的诊断试剂往往需要专门配套的仪器，试剂、仪器价 格昂贵；此外，其专利保护也限制了这些技术在我国国内的研发 化学发光酶免疫分析法(chemiluminescence enzyme immunoassay, CLEIA)综合了免疫分析和化学发光检测的优点， 具有特异性高、操作简便快速、高通量以及仪器简单价廉等特点 [13〜16],是一种适合在国内推广普及的临床诊断技术目前孕 酮CLEIA方法学的研究，很少报道究其原因，孕酮是小分子， 在人血清中大部分与蛋白结合，只有1%左右的呈游离状态[17], 因此测定总孕酮时要充分阻断其与蛋白的结合此外，与大分子 蛋白相比，小分子激素酶标记物和特异性抗体的制备和筛选更加 困难本研究采用HRP催化luminol H202化学发光体系，通过对免疫试剂稀释度的选择和反应条件的优化，建立了人血清中 孕酮的CLEIA,并对其进行了方法学评价。

将木法用于临床血清 中孕酮的分析，结果和市售RIA试剂盒的分析结果呈良好的相关 性2实验部分2. 1仪器试剂BHP9504微孔板发光分析仪（北京滨松光子技术有限公司）；DEM3型自动洗板机（北京拓普分析仪器有限责任公司）；XW 80A 型旋涡混合器（上海精科实业有限公司）;WZ 2A型微量振荡 器（北京海淀电子医疗仪器厂）；HH. W21 CrOOO电热恒温水箱 （北京长安科学仪器厂）；20〜200 μL可调定量加样器（大龙 医疗器械上海有限公司）HRP标记的孕酮（美国，Fitzgerald）；驴腿 IgG＞孕酮多克隆 兔抗、化学发光底物液、去激素人血清和RIA孕酮试剂盒（北京 科美东雅生物技术有限公司）；孕酮、睾酮、17β雌二醇、 雌三醇、皮质醇、牛血清口蛋口（BSA）、水解明胶、8 苯胺基1 蔡磺酸钠盐（ANS）和Tween 20 （美国Sigma公司）；其它试剂均为分析纯（北京化学试剂厂）；实验用水为二次蒸惚 水包被液：0. 06 mol/L柠檬酸缓冲液（pH=4. 8）封闭液：0. 05 mol/L 磷酸盐缓冲液（PBS, pH=7. 4,含 1%BSA 和 0. l%proclin 300）0 洗涤液：0. 05 mol/L PBS （含 0. 05% Tween 20）。

分析缓冲液:0. 05 mol/L PBS （pH=7.4,含 1% BSA、0. 8% 水解明胶和 0. 1% procl in 300）2. 2实验方法2. 2.1校准品的配制用十万分之一分析天平准确称量5 mg孕 酮，将其溶于5 mL乙醇得到1 g/L储备液，一20°C保存取 50 μL储备液，以50%乙醇溶液将其稀释至10 mg/L后，使 用进口去激素人血清作为校准品基质，继续稀释分别得到60、21、7.0、2.0及0.5 μ g/L 5个浓度的校准品，校准品基质 作为零校准点，4°C保存备用2. 2. 2驴抗兔IgG的纯化 采用饱和硫酸^（saturated ammonium sulfate, SAS）法纯化驴抗兔IgG取适量驴抗兔抗血清，加生 理盐水稀释后置于磁力搅拌器上，缓慢滴加同体积SAS溶液（饱 和度为50%）,室温放置2 h在低温离心机上4 °C离心30 min, 倾出上清液加适量生理盐水溶解沉淀，滴加SAS溶液至35%饱 和度，重复前面的操作再滴加SAS溶液至33%饱和度，其余 操作同前将第3次生成的沉淀溶于适量0. 02 mol/L PBS（pH=7.4）缓冲液中，透析。

离心去除沉淀用紫外分光光度计 （波长280 nm、光程1 cm）测其吸光度，按照摩尔吸光系数法 计算IgG的浓度加入0. 05%的生物防腐剂procl in 300,分装, -20 °C保存2.2.3固相抗体的制备 采用二抗间接包被法制备固相孕酮抗 体将纯化过的驴抗兔IgG用包被液稀释至8 mg/L,加入96 微孔板各孔中，150 μL/孔，4 °C放置18 h倾去包被液, 拍干加入封闭液350 μL/孔，室温封闭3 h甩掉封闭液， 加入孕酮多克隆抗体（用分析缓冲液稀释10万倍，150 μL/ 孔，4 °C过夜洗板，室温干燥24 h装入铝箔袋，抽真空密 封后4 °C保存备用2.2.4人血清中孕酮的化学发光酶免疫分析法在包被好孕酮抗 体的微孔板各孔中先后加入50 μL孕酮校准品或待测血清，100 μL HRP标记物，振荡0. 5 min使其充分混匀，37 °C温 育1 ho使用自动洗板机洗板5次，在吸水纸上拍干加入100 μL发光底物液，避光反应10 min后，将微孔板放入发光分 析仪进行读数2. 2. 5数据处理使用BHP9504微孔板发光分析仪自带的软件对 测得的数据进行处理。

以logitY为纵坐标，logX为横坐标，采 用直线拟合方式作图得到校准曲线：logitY=log[X/仃一X）],公 式中的Y=B/B0, B0和B分别指零校准孔和其它校准孔（或样品 孔）的发光计数X代表孕酮含量2.3样品的收集血样来源于解放军301医院门诊及住院病人空腹静脉采血，静 置，离心沉淀后，取上清液，分装，一20 °C保存备用3结果与讨论3. 1免疫试剂稀释度的选择通过棋盘滴定实验对孕酮抗体和HRP标记物的稀释度进行选择， 结果见表1主要考察了最大发光值B0,首、末校准点发光值与 最大发光值之间的比值Bl/BO、B5/B0o在竞争法中，B1/B0越小, 灵敏度越高竞争法通常又要求B5/B0在15%左右，因为如果 B5/B0太小（低于10%）,则末校准点发光值太低，会导致误差增 大为了同时保证方法的灵敏度、可靠性和线性范围，本实验选 择1 : 100000的孕酮抗体和1 : 15000的HRP标记物表1棋盘滴定实验（略）Table 1 Chessboard titration3.2不同发光底物的比较化学发光体系及发光底物的选择对化学发光免疫分析有着重要 的影响HRP催化luminol H202化学发光体系是一种广泛应 用的经典化学发光体系。

通常的鲁米诺化学发光底物液分为A液 和B液两部分，在检测前将两部分溶液按照一定比例混合后加 入测定体系，避光放置一段时间后检测其化学发光信号值•根据 底物液的稳定性及待测物的性质不同，其化学发光信号值一般在 5~10 min后达到最高值，并可在一定时间段内保持相对稳定本研究对比了两种不同配方的鲁米诺化学发光底物液（分别标示 为I号和II号，均由本实验室自行配制）其中，I号底物A液 和B液的混合体积比为100 : 1, H号底物A液和B液的混合体 积比为1 ： lo考察了两种发光底物的校准曲线随发光反应时间 的漂移情况，如图1所示使用I号发光底物时，校准曲线随发 光时间明显漂移(图la),检测时如果时间控制稍不严格，就容 易造成较大的批内变异使用II号底物，同样考察5、10、15和 20min时的校准曲线(图lb),发现其基木无漂移此外，同一 浓度校准品在相同的发光时间，II号底物的发光强度大于I号底 物发光强度大，则相对分析误差小综合考虑以上因素，最终 选用II号发光底物进行本研究的实验测定图1校准曲线随发光反应时间的漂移情况(a) I号发光底物(b) II号发光底物(略)Fig. 1 Drift of the kinetic curve along the luminescence time (a) substrate of I and (b) substrate of II (■) 5 min, (•) 10 min, (▲) 15min, (▼) 20 min。

3.3温育条件的优化温育时间均选定为lh,分别比较了 37 °C水浴、室温(23±2 °C) 振荡和室温静置3种条件对发光值和实验精密度的影响结果显 示，37 °C水浴反应时，零校准品的发光强度远大于室温振荡和 室温静置时，说明温度对加速免疫反应进程的影响非常显著， 37 °C时免疫反应更易达到平衡同时，37 °C水浴和室温振荡 时方法的相对标准偏差比较接近，但都小于室温静置其主要原 因在于较高的温度和温和的机械振动都会增加抗原抗体之间碰 撞的几率，从而使免疫反应能够更快达到平衡振荡还可以使微 孔板各孔间的反应最大可能的均一稳定这些都可以减小测定时 的变异综合考虑发光强度和方法的相对标准偏差，选用37 °C 水浴1 h作为温育条件3.4发光反应时间的确定在各种稳定剂、发光增强剂的作用下，HRP催化lum。