一种利用木糖混合营养培养小球藻的方法.docx

说明书摘要本发明公开了一种利用木糖混合营养培养小球藻的方法，其特征在于以细菌和小球藻构建 了一种菌藻共培养系统，在该系统中，细菌以木糖为碳源进行生长代谢，其代谢产物为小 球藻的混合营养生长提供有机碳源；利用该方法，小球藻细胞生长速率是其光合自养生长 的3倍以上本发明大大促进了小球藻的生长，缩短了光照培养的时间，减少了光照培养过 程中的能源损耗，同时可为微藻生物柴油的工业化生产提供大量原料权利要求书1. 一种利用木糖混合营养培养小球藻的方法，其特征在于以细菌和小球藻构建了一种菌藻 共培养系统，在该系统中，细菌以木糖为碳源进行生长代谢，其代谢产物为小球藻的混 合营养生长提供有机碳源2. 按照权利要求1所述的方法，其特征在于所用的细菌为纤维弧菌Cellvibriopealriver,在 中国普通微生物菌种保藏管理中心的保藏号为CGMCC 1.14955,保藏日期为2014年12 月21日3. 按照权利要求 1 所述的方法,其特征在于所用的小球藻为 Chlorella vulgaris4. 按照权利要求1所述的方法,其特征在于共培养系统是指Cellvibrio pealriver和Chlorella vulgaris同时接种到培养基中。

5. 按照权利要求1所述的方法，其特征在于菌藻共培养的培养基为BG11培养基中添加木 糖为碳源6. 按照权利要求1所述的方法，其特征在于混合营养培养方式指同时以Cellvibriopealriver 木糖代谢产物和CO2为碳源光照培养Chlorella vulgariso说明书一种利用木糖混合营养培养小球藻的方法专利名称一种利用木糖混合营养培养小球藻的方法技术领域本发明涉及了一种利用木糖混合营养培养小球藻的方法，收获的藻细胞可为生物柴油 的生产提供廉价原料背景技术生物柴油是一种绿色可再生的能源，近十几年来受到世界各国的普遍关注目前，生 物柴油主要来源于植物和动物油脂，世界各国根据自身国情选择合适的原料，欧盟各国以 菜籽油为原料，美国、南美洲的巴西 （世界第三大生物柴油产地，2011 年 250 万吨） 和阿 根廷 （世界第四大生物柴油产地，2011 年 230 万吨） 主要以大豆油为原料，东南亚国家主 要利用棕榈油生产生物柴油，日本则以餐厨废油为主要原料稳定的油脂原料供应是当前 国外生物柴油产业快速发展的关键之一，但现有的产量在第一大产区欧盟也仅有 5%的市场 份额，生物柴油的进一步发展将消耗大量的油脂原料，这对农业和林业的健康发展将造成 巨大的压力；特别在人口众多、人均耕地面积稀少的中国，大豆和粮油主要依靠进口，生 物柴油的发展需在“不与民争粮油、不与粮油争地”的原则下积极开发非粮油原料来源。

面对植物原料生产生物柴油的诸多问题，微藻生物柴油越来越受到各国的重视小球藻是 一类单细胞藻类，属于绿藻门，种类繁多，在淡水河海水中均有广泛分布，在人工培养条 件下也能良好生长，是第一种人工培养的微藻由于小球藻分布广、生长快，易培养等优 点，成为生产生物柴油的重要原料来源木质纤维素中~30%为半纤维素，半纤维素水解产物的 85~90%是木糖木糖作为一种 可发酵糖，其发酵产乙醇能使纤维素原料的乙醇产量在原基础上提高 25%以上，在纤维素 乙醇工业中备受瞩目在微藻的培养中，木糖作为碳源进行异养或混合营养培养的研究和 应用还很少°Yang等人的研究发现Scenedesmus obliqu可以木糖为碳源进行混合营养生长, 但不能进行异养生长，且当藻浓度低木糖浓度高时，藻细胞生长受到抑制，到第 10d 后才 开始利用 木糖（ Sequential heterotrophy-dilution-photoinduction cultivation for efficient microalgal biomass and lipid production. Bioresource Technology, 2012, 112: 206-211.）。

Zheng 等人研究也发现，受诱导 （微藻先在葡萄糖培养基中培养，得到的细胞即为受过诱导的细 胞） 的 Chlorella sorokiniana 代谢木糖的能力很强，而未诱导的细胞能力却很弱；他们推测 C. sorokiniana 细胞中存在一种己糖运载体，这个载体被诱导激活后木糖才能被运载进入藻 细胞，被木糖还原酶和木糖醇脱氢酶转化为木酮糖进入磷酸戊糖途径（ NAD（P）H-linked xylose reductase and NADP+-linked xylitol dehydrogenase in the oleaginous microalga Chlorella sorokiniana. Biotechnology for Biofuels, 2014, 7: 125.）综合已有的研究结果，木糖对微藻细 胞生长有一定的抑制作用，藻细胞必须经过诱导或长时间的适应才能利用木糖为碳源进行 混合营养生长因此，研究利用木糖促进小球藻生长的方法对节约微藻生产成本，发展生 物柴油工业有重要意义发明内容 针对小球藻光合自养生长慢的特点，利用小球藻兼性化能异养的生长特性，本发明提 供了一种利用木糖混合培养小球藻的方法，以细菌和小球藻构建了一种菌藻共培养系统， 在该系统中，细菌以木糖为碳源进行生长代谢，其代谢产物为小球藻的混合营养生长提供 有机碳源。

本方法大大促进了小球藻的生长，缩短了光照培养的时间，减少了光照培养过 程中的能源损耗，同时可为微藻生物柴油的工业化生产提供大量原料本发明提供了一种利用木糖混合培养小球藻的方法，所构建的共培养系统是将细菌和 小球藻同时接种到培养基中；所用的细菌为纤维弧菌Cellvibriopealriver,在中国普通微生 物菌种保藏管理中心的保藏号为CGMCC 1.14955 （如图1菌株保藏文件所示），保藏日期 为 2014年12月21 日；所用的小球藻为 Chlorella vulgaris本发明提供了一种利用木糖混合培养小球藻的方法，所用培养基为 BG11 培养基中添 加木糖为碳源，所用培养方式为以Cellvibriopealriver木糖代谢产物和CO2为碳源光照培养 Chlorella vulgaris具体实施方式 下面结合实施例对本发明的技术内容作进一步的说明；下述实施例是说明性的，不是 限定性的，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围实施例一：BG11 培养基中添加 1g/L 的木糖为菌藻共培养培养基，按 1%的接种量分别接种 Cellvibrio pealriver和Chlorella vulgaris FACHB-8 （购买自武汉中国科学院野生生物种质库 ——淡水藻种库）进行共培养；对照组分别以①BG11和②BG11+1g/L木糖为培养基培养 小球藻。

培养过程中每天取5ml培养液提取藻叶绿素a（Chl a）,测定结果如图2所示，培 养2d后藻细胞快速生长，其生长速率是其光合自养生长的3倍，第5d，共培养系统中微 藻Chl a达到7.75mg/L；对比对照组①和②的结果，木糖对小球藻生长有一定抑制作用； 对培养过程中还原糖含量的测量表明，小球藻不能单独利用木糖，而在共培养系统中，还 原糖含量急剧下降，到第 4d 时已消耗殆尽综合上述结果我们可知，利用菌藻共培养体系， 木糖可能被 C. pearlriver 转化为一种促进 C. vulgaris 生长的物质，以木糖为碳源进行混合营 养培养能显著地促进了小球藻的生长实施例二：BG11 培养基中添加 5g/L 的木糖为菌藻共培养培养基，按 1%的接种量分别接种 Cellvibrio pealriver 和 Chlorella vulgaris FACHB-8 进行共培养；对照组分别以① BG11 和② BGll+5g/L木糖为培养基培养小球藻培养过程中每天取5ml培养液提取藻叶绿素a （Chl a）,测定结果表明，培养2d后藻细胞快速生长，其生长速率是其光合自养生长的3〜4倍， 第5d,共培养系统中微藻Chl a达到10.21mg/L，比在BG11中光合自养生长的2.76 mg/L 提高了3.7倍。

上述结果说明提高木糖的浓度有利于提高小球藻细胞的积累量实施例三：BG11培养基中添加1g/L的木糖为菌藻共培养培养基，按5%的接种量接种Cellvibrio pealriver和1%的接种量接种Chlorella vulgaris FACHB-8进行共培养；对照组分别以① BG11和②BG11+1g/L木糖为培养基培养小球藻培养过程中每天取5ml培养液提取藻叶 绿素a（Chl a），测定结果表明，培养1d后藻细胞快速生长，其生长速率是其光合自养生 长的2~3倍，第5d,共培养系统中微藻Chl a达到7.21mg/L，比在BG11中光合自养生长 的2.81mg/L提高了 2.6倍上述结果说明提高Cellvibriopealriver的接种量有利于缩短小球 藻适应环境的时间，减少小球藻培养的时间实施例四：BG11培养基中添加1g/L的木糖为菌藻共培养培养基，按1%的接种量接种Cellvibrio pealriver和5%的接种量接种Chlorella vulgaris FACHB-8进行共培养；对照组分别以① BG11和②BG11+1g/L木糖为培养基培养小球藻培养过程中每天取5ml培养液提取藻叶 绿素a（Chl a），测定结果表明，培养1d后藻细胞快速生长，其生长速率是其光合自养生 长的2~3倍，第5d,共培养系统中微藻Chl a达到8.14mg/L，比在BG11中光合自养生长 的2.97mg/L提高了 2.7倍。

上述结果说明提高小球藻的接种量有利于缩短藻细胞适应环境 的时间，减少小球藻培养的时间附图说明中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心China General Microbiological Culture Collection Center (CGMCC)Address: Institute of Microbiology, Chinese Academy of Sciences, Datun Road, Chaoyang District, Beijing 100101, China Telephone: 86-10-64807355 Fax: 86-10-64807288 E-mail: cgmcc@ Homepage: www.cgmcc.ncl受理通知书NOTIFICATION OF RECEIPT CGMCC 1.149551. Name and address of the depositor or agent谢章彰 Zhang-Zhang XIESouth China University of TechnologyGuangzhou 510006, P. R. China2. Strain reference given by depositorC.PR13. Deposited microorganisms appended□ Scientific description■ Proposed taxonomic nameCellvibrio peal river4. The deposited microorganism has been received and numbered as CGMCC 1.14955 on October 2014 . The strain has been checked for viability in the CGMCC and is stored using one of the standard methods used in the CGMCC.5.。