挥发性脂肪酸地测定.docx

挥发性脂肪酸的测定名称分子式沸点/°c名称分子式沸点/°c甲酸HCOOH100.8丁酸C H COOH162.3乙酸CH COOH117.5戊酸3 /C H COOH185.5丙酸3C H COOHn c140.0已酸4 9CH COOH 1205.0附表 5 低级脂肪酸的分子式及沸点一般来说，碳原子数在10 以下的脂肪酸大部分具有挥发性，并且易溶于 水在它们中间，随着碳原子数的增加，挥发性逐渐下降典型的挥发酸见 附表 52 5 5 11挥发性脂肪酸易被微生物利用在有机物的厌氧分解中，挥发性脂肪酸 是作为生物代谢的中间或最终产物而存在在厌氧发酵的液化产酸阶段，这 一类低级脂肪酸是这一阶段的主要产物，其中以乙酸为主在某种条件下， 乙酸可以达到该类酸总量的80%在CH4形成过程中，甲酸和乙酸是形成甲烷 的重要前体物据研究，自然界有机物产生的CH4中大约有70%上由乙酸中的 甲基原子团形成的丙酸、丁酸可以转化成甲酸有机酸过多往往反映出发 酵池的病态因此可以认为，在微生物厌氧发酵过程中，挥发性脂肪酸不仅 是一种不可缺少的营养成分，更重要的意义在于这类有机酸已是沼气发酵研 究有机物降解工艺条件优劣的重要参数，在甲烷形成的研究和生产中，它们 的含量也是重要的参数。

在挥发性脂肪酸的总量测定中，是以乙酸作为基数进行计算，除了要求 测定总量外，对甲酸、乙酸等各种低级脂肪酸的分别定量分析也是十分重要 的1 C2〜C5挥发性脂肪酸的气相色谱测定法2.5.1.1 测定原理使用色谱仪上的氢火焰检测器测定挥发性脂肪酸含量，其基本原理是： 色谱柱分离后馏出的物质被载气载入检测器离子室的喷嘴口，与燃烧气—氢 气相混合，并以空气助燃气进行燃烧，以此为能源，将组分电离成离子数目 相等的正离子和负离子（电子）在离子室内装有收集极和底电极，因此离 子在电场内作定向流动，形成离子流该离子流被收集极收集后，经过微电 流放大器放大输送给记录仪得到信号，此信号的大小代表单位时间内进入检 测器火焰的组分含量2.5.1.2 测定条件⑴试剂设备① 乙酸、丙酸、丁酸、戊酸混合标准液的配制分别吸取乙酸（A.R., 相对密度1.045，含量99%）、丙酸（A.R.，相对密度0.9987，含量99.5%）、 丁酸（A.R.，相对密度0.8097，含量99%）、戊酸（A.R.，相对密度0.934, 含量100%）各25|iL于50mL容量瓶中，再加入2.5mL甲酸（A.R.，相对密度 1.22，含量 88%），最后用蒸馏水定容。

其中乙酸、丁酸、戊酸的浓度分别为 517|iL/L、497|iL/L、401 L/L、467|iL/L② 6mol/ L 硫酸的配制：将 167mL 浓硫酸（相对密度 1.84 ）缓慢倒入 833mL 蒸馏水中③ 甲酸：相对密度 1.22 ，含量 88% ④ 离心机4000〜16000r/min⑤ 气相色谱仪， FID 检测器⑵ 样品预处理 用沼气发酵液 7mL 加入 2 滴 6mol/ L HSO 使 pH 值降至 243.5左右（用pH试纸粗测），离心20〜30 min,取上层透明清液3mL,加入0.15 mL浓甲酸，最终pH值为2.0左右（控制在3.0以下）⑶ 主要实验参数① 条件一固定相：GDX +HP0, 2%（60〜80目）；色谱柱：2mX^6mm;103 3 4柱温：180〜200°C;气化室温度：240°C;检测温度：210°C;进样量：2 ^L; 载气流量：N , 50mL/ min;氢气流量：50 mL/ min;空气流量：600〜700 mL/2min;衰减：X1/8② 条件二色谱柱：2mX^ 3mm，不锈钢柱，内填国产GDX-401担体， 60〜80目；柱温：210°C;载气：N，流率为90mL/ min;空气流率：500 mL/2min;氢气流率：50 mL/ min;气化室温度：240°C;检测温度：210°C。

③ 条件三色谱柱:2mX^ 6mm，装有以2%磷酸饱和的60〜80目GDX-103 担体；柱温：180〜200°C;气化室温度：240;检测温度：210°C;进样量： 2 L;载气流量：N ， 50mL/ min;氢气流量：50 mL/ min;空气流量：600〜2700 mL/ min;④ 条件四色谱柱：2mX2mm，玻璃柱，内装有10%的商品固定液 FluoradFC431 涂布的 Supelcoport 担体，100〜200 目；柱温：130°C;气化 室温度：220°C;检测温度：210°C;载气流量：N ， 40mL/ min2⑷ 定性与定量① 定性配制模拟标准样品，用已知物质的保留时间对照被测物质的保 留时间进行定性② 定量用已知样校正法进行定量，其方法是配制已知浓度的标准样（与 样品组分一致），进行色谱试验，测量标准样各组分的峰高（或峰面积）， 求出组分 i 的单位峰高（或峰面积）的组分含量或作出峰高和浓度的标准曲 线当样品组分浓度变化不大时，可采用单位校正法当样品组分浓度变化 很大时，则需预先用校准样作出浓度和峰高或峰面积的标准曲线，观察其标 准曲线是不是通过原点的直线，即是否呈线性。

若呈线性，就可用单点校正 法，按下面的公式计算：C xH 总i H i Vs 样C——待测样品浓度，uL/L;iH ——待测样品峰高， mm;iC——标准样品浓度，^L/L;sH ——标准样品峰高， mm;sV ——待测样品体积+甲酸体积， mL; 总V ——待测样品体积， mL2.5.1.样3 方法的精度和注意事项⑴ 以 GDX +H PO 2% 为固定相，比用 GDX 、 PEGS 、 Porapak.N 等作为固103 3 4 101 定相其保留时间短，且峰形对称⑵ 本法最小检测量为4^L/L，相对误差为1.8%,相对标准偏差〈2.7% （以乙酸计）⑶ 有机酸是一种强极性物质，沸点较高，由于担体对酸的吸附，常常引 起酸峰拖尾和鬼峰的出现因此，取有机酸直接进样测定时，为了抑制酸的 吸附，可采取以下措施① 在样品中加入一定量的浓甲酸（相对密度 1.22，含量 88%），使其甲 酸加入量（体积）与样品的体积比为 5：100甲酸是一种一元羧酸，离解常 数（2.11X10-4 ）大于其他任何一元羧酸，当含有甲酸的样品进入固定相时， 担体表面的吸附中心位置被甲酸暂时占据，这样便抑制了 C〜C酸被担体的吸25 附。

此外，甲酸在 FID 上响应很低，故对其他组分的应答影响不大② 酸的吸附还发生在接近进样口的地方，由于进样口常积累有碳质沉积 物，通常采用蒸馏水清洗进样口，并用1.5%磷酸-丙酮液来浸泡进样口，然后 在约150°C的温度下将进样口烘烤4〜8h③ 用1 . 5%磷酸-丙酮液来浸泡柱口玻璃毛④ 在分析高浓度时，一定分析周期内注射水或 15%甲酸液来洗涤被柱子 吸附的酸⑤ 操作条件恒定以后，在进标准酸样或样品之前，用 15%的甲酸液来冲 洗柱子 3〜4 次⑷ 柱子使用寿命大约 4〜6 个月，一旦发现色谱峰出现拖尾或重复性差， 则必须更换柱⑸ 尽管采取了一系列防止吸附的措施，但柱子的吸附问题还是不可能完 全解决，特别是对于4000 uL/L以上高浓度的酸样，如何克服吸附问题还值 得更进一步研究⑹ 当检测器的灵敏度显著降低或更换新柱之后，重新做校正曲线2 挥发性脂肪酸总量的比色测定法2.5.2.1 测定原理含挥发性脂肪酸的样液，在加热的条件下，与酸性乙二醇作用生成酯， 此酯与羧胺反应，形成氧肟酸在高铁试剂存在下，氧肟酸转化为高铁氧肟 酸的棕红色络合物，其颜色的深浅在一个较大的范围内与反应初始物——挥 发性脂肪酸的含量成正比，故可用比色法测定。

2.5.2.2 测定方法⑴ 试剂①1:1硫酸：浓硫酸（相对密度1.84，C.P.）加到同体积蒸馏水中稀 释配制② 酸性乙二醇试剂：取30.0mL乙二醇（C.P.）与4.0mL配制的稀硫酸混 合③ 4.5mol/L的氢氧化钠：称取180g氢氧化钠（C.P.）溶于水中，冷后以 蒸馏水稀释至 1L④ 10%硫酸羟胺溶液：称取硫酸羟胺（C.P.）IO.Og,溶于100mL蒸馏水中⑤ 羟胺试剂：量取20.0 mL4.5mol/L的氢氧化钠，与5.0mL10%的硫酸羟 胺相混合⑥ 酸性氯化铁试剂：将20.0g分析纯FeCl 6H0溶于500mL水中，准确3・ 2加入20.0 mL浓硫酸，并以蒸馏水稀释至1L⑵ 测定程序① 乙酸标准液的配制精确称取乙酸（分析纯，相对密度 1.045，含量99.0%） 1.010g，以蒸馏水稀释至100mL,此溶液含乙酸10mg/mL准确吸取 10mg/mL 乙酸标准溶液 1.0mL、5.0mL、10.0mL、15.0mL、20.0mL、25.0mL、30.0mL，分别置于100.0mL容量瓶内，以蒸馏水定容至刻度，摇匀， 即得 100|dL/L、500|dL/L、1000|dL/L、1500|iL/L、2000 L/L、2500 L/L、 3000 |i L/L的乙酸标准系列液。

② 标准曲线的绘制取相对密度 1.045 的乙酸（分析纯）试剂，制成50mL/L、 100mL/L、 500mL/L、 1000mL/L、 1500mL/L、 2500mL/L、 3000mL/L 的系列标准液，分别吸取0.5 mL分置于试管中（12.5cmX 1.5cm），每瓶中 准确加入，于沸水浴中加热3min,然后立即以冷水冷却；再加入2.5mL羟胺 试剂，充分摇匀，然后，充分振荡混匀，以蒸馏水定容，用 721 型分光光度 计以 500nm 波长测定其光密度，绘制标准曲线，以横坐标表示浓度值，纵坐 标表示光密度值③ 样品的测定以4000〜10000r/min的离心条件，制取沼气发酵样品 澄清液，吸取0.5mL样液置于试管中（12.5cmX 1.5cm），准确加入1.7 mL 酸性乙二醇试剂，充分混合，于沸水浴中加热3min,应避免试管与加热器壁 直接接触然后立即将试管置于冷水中冷却加入2.5mL羟胺试剂，并混匀， 放置 1 m i n ，然后全部倒进盛有1 0m L 酸性氯化铁试剂的 25mL 容量瓶中，用蒸 馏水定容，并充分摇匀，静置5min,用分光光度计以500nm波长测定光密度。

同样操作做空白试验 1 份 计算挥发性脂肪酸=C X V1 X103 （mg/L）V式中 C 样液光密度值相应于标准曲线上挥发酸的含量，mg;V 测定样液体积，mL ；VI 测定时液样的稀释倍数2.5.2.3 注意事项① 此方法是挥发性脂肪酸总量的经验测定法，比蒸馏法测定更为简便、 快速除 150mg/L 以下的低浓度范围外，其测定值相对误差与气相色谱法测 定总值的相对误差相近② 此法中的反应是在严格的pH值条件下进行的，最适pH值为1.6±0.1pH值高于2.0时，色度加剧，pH值低于1.0时，颜色难以稳定，易消失③ 酸性己二醇试剂和羟胺试剂宜使用时配，也可在测定中配入例如，以加入1.5mL己二醇和0.2mL稀硫酸来代替1.7mL酸性己二醇试剂，以0.5mL硫酸羟胺和2.0mL4.5mol/L的氢氧化钠来代替2.5mL羟胺试剂④ 如果所做的空白测定含量酸量超过200mg/L时必须用氢氧化钠蒸馏提 纯己二醇 ⑤ 酸性氯化铁配制好后，应静置过夜，弃去沉。