
分子生药学.docx
10页© 全国中医药行业高等教育“十三五”规划教材 矽 全国高等中医药院校规划教材(第十版)分子生药学(新世纪第二版)(供中药学、中药资源与开发、中药制药、药学等专业用)主编刘春生袁媛企国百佳图书出版单 申国中医药出版订第一章 绪论1945 年,提出分子生物学一词1953年,发现DNA双螺旋模型1983 年,提出聚合酶链式反应设想1985 年,发明了聚合酶链式反应1995 年,我国科学家黄璐琦院士首次提出了分子生药学概念1.分子生药学是在分子水平上研究中药的鉴定,质量的形成及活性成分生产的一门学科 2.分子生药学的主要研究对象是生物来源药材3.分子生药学的任务:① 从分子水平研究中药的鉴定② 在分子水平研究中药的质量形成③ 中药活性成分的生物合成与生产第二章 基本技术原理1变性:在过酸,过碱,加热等理化因素的作用下,DNA分子互补碱基对之间的氢键断裂,DNA 双螺旋解链变成两条单链2.增色效应:在 DNA 解链过程中, 260nm 处的吸光度增加,增加量于解链程度呈一定的比 例关系,称为 DNA 的增色效应3•复性:变性的DNA在适当条件下,两条互补链可以重新恢复天然的双螺旋构象4. 退火:热变性的DNA在缓慢冷却时发生复性过程。
5. 减色效应:在复性的过程中,DNA溶液的OD260值会减少6. 去除杂质:① 蛋白质和RNA的去除:温浴结束后加入氯仿:异戊醇比为24 :1② 多糖和淀粉的去除:如果提取物中多糖和淀粉含量高,可以利用其与DNA在不同盐溶液 中的溶解性差异,去除多糖类杂质的目的③ 去除酚类物质在DNA提取缓冲液中加入防止分类氧化的试剂,如0巯基乙醇,抗坏 血酸,半胱氨酸,二流苏糖醇7.DNA 质量检测纯的DNA沉淀为白色干后透明干后是白色,则说明蛋白质类杂质较多,若呈黄色至棕色, 则含有多酚类杂质,若呈胶冻状,则含有多糖类杂质DNA 质量检测的方法:① 有紫外分光光度法(DNA在260nm处有最大吸收峰,蛋白质在280nm处有最大吸收峰)② 琼脂糖凝胶电泳法8•聚合酶链式反应(PCR)(1) Kary Mullis在1985年提出,并在1993年获得诺贝尔奖2) PCR 模拟了 DNA 复制过程,其特异性主要体现在与靶序列两端互补的寡核苷酸引物 上3) PCR反应三步骤:变性,退火,延伸① 变性:将待扩增的模板DNA加热至94°C,双链解离变成单链变性温度低易引发解链不 完全,过高导致聚合酶活性有影响,一般为93〜95C,30〜60s。
② 退火:温度降至55C左右,引物与模板结合退火温度根据引物的Tm值决定一般为50〜 72C,60〜60s,在允许的范围内选择较高的退火温度能够提高PCR反应的特异性③ 延伸:温度升高至72C,在DNA聚合酶下,以dNTP为底物,按照碱基互补配对和半保 留复制的原则,合成一条新的DNA延伸的时间根据待扩增片段的长度来设定9.PCR体系组成:由引物,DNA聚合酶,dNTP,模板,Mg离子,反应缓冲液组成10•影响PCR的主要因素① 引物(引物的设计是决定PCR产物特异性的关键)② DNA聚合酶③dNTP,④模板DNA⑤Mg2+⑥温度参数⑦循环次数(根据模板DNA的浓度和靶序列的丰度一般为20〜40次,尽量减少循环次数)11•设计引物遵循的原则:① 长度15〜60bp,常为20bp左右② 最适宜的扩增长度为200〜500bp③ 其中 G+C 含量为 40%-60%位宜过高则扩增效果不佳,过低则易产生非特异性产物,四 种碱基最好随机分布,避免五个以上连续排列的嘌呤和嘧啶核苷酸 ④避免引物内部出现二级结构及两条引物互补的现象⑤ 引物 3'端的碱基,尤其最末及倒数第二个碱基需要严格与模板配对,避免由于末端碱基配 对不成功,导致PCR反应失败和非特异性扩增。
⑥ 引物必须与该物种其他DNA序列无明显的同源性⑦ PCR反应中,每条引物的浓度保持0.1〜lumol/L保重,以保证进行特异性扩增的最低引 物量,引物浓度偏高,易导致错配及非特异性扩增12.PCR技术的种类①反转录PCR(RT-PCR②巢式PCR③实时荧光定量PCR (适用于定量检测)④ 不对称PCR(关键点在于上下游引物的浓度比例相差较大,其主要产物仍然为双链DNA 多用于制备探针,进行序列分析和核酸杂交)⑤ 多重 PCR13•多重PCR:在同一反应中,利用多组引物,同时对几个不同的DNA片段进行扩中,当其 中的某一段DNA缺失,则电泳谱上相应的条带就会消失主要用于多个突变位点的检测和 基因分型14.DNA体外重组常用载体:以原核细胞为宿主的载体主要有质粒载体和久噬菌体载体 以真核细胞为素质的载体主要为病毒载体15•—种理想的质粒载体应当具备以下条件:① 分子相对较小(可使限制性内切酶在质粒上的酶切位点减少)② 拷贝数较多(可导致克隆的外源基因量增加,一般选择松弛性质粒)③ 在复制子以外的适当位点构建几个限制性内切酶的单一酶切位点最好位于易于检测的表 型性状相关基因上④ 赋予宿主细胞易于检测的表型。
16・目前常用两种方法制备载体:① 在这里中构建抗生素抗性基因以便为寄主细胞提供易于检测的表型性状② 利用外源DNA插入质粒转化大肠埃希菌后形成的紧咯颜色变化17.DNA连接方式:平末端连接,黏末端连接两种方式19・目的DNA与载体重组方法转化:外源DNA转入宿主细胞并获得新表型的过程 转导:由噬菌体和细胞病毒介到的转化转染:相对于原核细胞,真核细胞导入外源DNA片段获得新表型的过程称为 20・目的基因表达:① 外源基因的原核表达 常见的原核受体菌有:1) 大肠埃希菌(大肠埃希菌表达系统由启动子,核糖体结合位点和转录终止子三部分构成 )2) 枯草芽孢杆菌3)棒状细菌4)蓝细菌② 外源基因的真核表达5 种表达系统:酵母表达系统,丝状真菌表达系统,昆虫细胞表达系统,植物表达系统,哺乳 动物表达系统21.DNA变异的来源有三种:基因突变,染色体畸变,基因重组22・基因突变:指一个基因内部遗传结构和 DNA 序列的改变,包括一对或少数几对碱基的缺 失,插入或置换而导致的遗传变化23•基因重组:由于不同DNA链的断裂连接,而使DNA片段交换和重新组合,形成新的DNA 分子的过程24•分子标记:遗传标记的一种以生物个体间遗传物质那核苷酸序列变异为基础的遗传标记, 是 DNA 水平遗传变异的直接反映。
第一代分子标记技术--RFLP 为代表; 第二代分子标记技术---RAPD、AFLP、SSR、ISSR 第三代分子标记技术--单核苷酸多态性(SNP)为代表,其余都是第二代25. RNA的结构① 基本结构单位是核糖核苷酸② 核糖核苷酸由碱基,D-核糖和磷酸组成③ 碱基有4 种 A.G.C.U④ 一级结构是直线型的多聚核糖核苷酸,各个核糖核苷酸之间通过3'-5'-磷酸二酯键连接, 形成单链分子天然二级结构只有部分区域具有类似DNA的双螺旋结构26. RNA的分类(基因组的转录产物分类)① 编码蛋白质的RNA,即信使RNA(mRNA)② 无蛋白质编码功能的RNA,称为非编码RNA(ncRNA)③ 能编码蛋白质,又以蛋白质的形式发挥生理作用,又能直接以RNA形式起作用,称为 双功能 RNA(cncRNA)27•总RNA的提取方法:常用的有Trizol法,CTAB和试剂盒法等28.RNA的检测方法:①紫外分光光度法(RNA的纯度可用OD260/OD280的比值来衡量),②琼脂糖凝胶电泳法 29•基因组:生物体和细胞中包含的一套完整的单倍体遗传物质的总和30•基因表达分析常用方法:Northern杂交,反转录PCR(RT-PCR)实时荧光定量PCR(RT-qPCR)转录组分析。
补充知识点,Sorthen法检测DNA,westhen法检测蛋白质31•转录组的主要分析技术有:基因芯片技术,表达序列标签技术,基因表达系列分析技术, RNA 测序技术32•真核生物的顺式作用元件:启动子,增强子,沉默子,绝缘子和终止子33•表观遗传变异涉及的分子机制:DNA甲基化修饰、蛋白质共价修饰、非编码RNA调控、 染色体重组34.DNA甲基化:是指在DNA甲基转移酶的催化下,以S-甲硫氨酸(SAM)为甲基供体,将甲 基集团转移到胞嘧啶上,形成5-甲基胞嘧啶的过程 (若出简答题举例某一道地药材)是最早 发现的途径方法有4类:①甲基化敏感扩增多态性②亚硫酸盐测序法③甲基化DNA免疫共沉淀法 ④ 高分辨率溶解曲线法35•非编码RNA(ncRNA)根据其功能可分为两大类:① 持家ncRNA:一般为组成型表达,是细胞正常功能必不可少的② 调节RNA:又称为核糖核酸调节子,一般在组织发育和分化的特定阶段表达,或由外界环 境信号诱导表达持家RNA种类和功能简单了解P30)36・ncRNA数据库分为:①通用ncRNA数据库;②专门的ncRNA数据库;③从高通量RNA 测序获得的转录本中得到的ncRNA数据库。
37蛋白质的性质(了解)① 蛋白质的酸碱性质② 蛋白质的胶体性质③ 蛋白质的沉淀④ 蛋白质的变性和复性⑤ 蛋白质的呈色反应38. 蛋白质分离纯化① 根据分子大小不同纯化(透析和超滤,离心沉降法,凝胶过滤★);② 按溶解度差别纯化(等电点沉淀,盐析,有机溶剂分级^)③ 按电荷不同纯化(电泳,离子交换层析);④ 按配体结合的特异性纯化;⑤ 高效液相层析39. 蛋白质组学:以蛋白质组为研究对象,从整体的角度分析细胞内动态变化的蛋白质组成成 分,表达水平和修饰状态,了解蛋白质之间相互作用和联系,从而揭示蛋白质的功能与细胞 生命活动规律40:蛋白质组研究的基本技术方法① 双相凝胶电泳技术② 蛋白质芯片技术③ 层析技术④ 生物质谱技术⑤ 生物信息技术⑥ 定量蛋白质组41: DNA的解链温度Tm:增色效应能够衡量DNA变形的程度,当紫外光吸收值达到最大 值50%时的温度称为DNA的解链温度Tm,其值与G+C含量有关第三章 中药分子鉴定1. 中药传统鉴定方法:基原鉴定、性状鉴定、显微鉴定、理化鉴定、分子鉴定2•中药分子鉴定;利用中药中的大分子信息进行中药鉴定的方法冲药中的大分子包括DNA, RNA 和蛋白质。
3・2010年版的中国药典首次收载了蕲蛇和乌梢蛇饮片特异性PCR鉴别法2012-2014年《中国药典》增补本先后收载川贝母PCR-RFLP鉴别法和中药材DNA条形 码分子鉴定法指导原则4・中药分子鉴定主要可以分为基于分子杂交的鉴定技术,基于 PCR 扩增的鉴定技术和基于 DNA 序列分析的鉴定技术5・物种形成的方式:渐变式物种形成,爆发式物种形成6・中药系统鉴别法的核心是抓住生物信息的两大核心要素:遗传信息和表型特征(达到对生物 类药材客观化,精确化的鉴定 )7・ 中药系统鉴定法的具体实施过程主要包括:① 首先,对待鉴定样本进行基原鉴定(对完整的原植物而言)、性状鉴定(对药用植物药用 部位或药材饮片而言),明确样本的形态、性状特征;② 然后对鉴定样本进行切片、粉碎等,取其中一部分进行显微鉴定,按照有关显微鉴定方法 进行操作,明确待鉴定样本的显微特征;③ 如果必要,可对药材粉末进行化学成分的初步判别,如生物碱类、皂苷类、黄酮类等的理 化显色反应,或薄层色谱。












