《生物化学实验》教学课件—27-底物浓度对酶促反应速度的影响-米氏常数的测定.pptx

生物化学实验技术生物化学实验技术底物浓度对酶促反应速度的影响米氏常数的测定实验类型：综合性实验类型：综合性实验类型：综合性实验类型：综合性教学时数：教学时数：教学时数：教学时数：6 6生物化学实验技术一、实验目的一、实验目的1、了解底物浓度对酶活力的影响了解底物浓度对酶活力的影响2、学习测定米氏常数的方法学习测定米氏常数的方法生物化学实验技术二、实验二、实验原理原理 酶促反应酶促反应速度与底物浓度的关系可用米氏速度与底物浓度的关系可用米氏方程来表示：方程来表示： Linewaeaver-Burk作图法（双倒数作图法）作图法（双倒数作图法）是用实验方法测是用实验方法测Km值的最常用的简便方法：值的最常用的简便方法：生物化学实验技术 于是于是实验时可选择不同的实验时可选择不同的S，测对应的，测对应的v；以；以1/v对对1/S作图，得到一个斜率为作图，得到一个斜率为Km/v的的直线该直线截距的负倒数为直线该直线截距的负倒数为Km值 本本实验利用胰蛋白酶消化酪蛋白为例，采实验利用胰蛋白酶消化酪蛋白为例，采用用Linewaeaver-Burk双倒数作图法双倒数作图法测定测定Km值值胰蛋白酶催化蛋白质中碱性氨基酸（胰蛋白酶催化蛋白质中碱性氨基酸（L-Arg和和L-Lys）的羧基所形成的肽键水解。

水解时有的羧基所形成的肽键水解水解时有自由氨基生成，可通过甲醛滴定法判断自由氨自由氨基生成，可通过甲醛滴定法判断自由氨基增加的数量，从而跟踪反应过程，求得初速基增加的数量，从而跟踪反应过程，求得初速度生物化学实验技术三、仪器与试剂三、仪器与试剂1、仪器：恒温水浴锅、仪器：恒温水浴锅2、试剂、试剂：1040g/L酪蛋白溶液（酪蛋白溶液（pH8.5），中性中性甲醛甲醛溶液溶液，0.25%酚酞酚酞，标准标准0.1 mol/L NaOH溶液溶液生物化学实验技术四、实验内容四、实验内容（一）（一）pH对酶活力的对酶活力的影响影响1、取、取50mL三角瓶三角瓶4个，加入个，加入5mL甲醛与甲醛与1滴滴酚酞，以酚酞，以0.1mol/L标准标准NaOH滴定至微红色，滴定至微红色，4个瓶颜色应当一致，编号个瓶颜色应当一致，编号生物化学实验技术2、量取、量取40g/L酪蛋白酪蛋白50mL，加入三角瓶，加入三角瓶，37保温保温10min；同时胰蛋白酶液也在；同时胰蛋白酶液也在37保保温温10min，然后吸取，然后吸取5mL酶液加到酪蛋白液中酶液加到酪蛋白液中同时计时！）充分混合后立即取出（同时计时！）充分混合后立即取出10mL反反应液（定为应液（定为0时样品）加入一含甲醛的小三角时样品）加入一含甲醛的小三角瓶中（瓶中（1号），加号），加10 滴酚酞；以滴酚酞；以0.1mol/L NaOH滴定至微弱而持续的微红色。

在接近终滴定至微弱而持续的微红色在接近终点时，按耗去的点时，按耗去的NaOH毫升数，每毫升加毫升数，每毫升加1滴酚滴酚酞，再继续滴至终点，记下耗去的酞，再继续滴至终点，记下耗去的0.1mol/L NaOH的毫升数的毫升数生物化学实验技术3、在、在2min、4min、6min时，分别取出时，分别取出10mL反应液，加入反应液，加入2号、号、3号、号、4号小三角瓶，同上号小三角瓶，同上操作，记下耗去操作，记下耗去NaOH毫升数4、以滴定度（即耗去的、以滴定度（即耗去的NaOH毫升数）对时间毫升数）对时间作图，得一直线，其斜率即初速度，为作图，得一直线，其斜率即初速度，为V40（相（相对于对于40g/L的酪蛋白浓度）的酪蛋白浓度）生物化学实验技术5、分别量取、分别量取30g/L、20g/L、10g/L的酪蛋白溶的酪蛋白溶液，重复上述操作，分别测出液，重复上述操作，分别测出V30、V20、V106、利用上述结果，以、利用上述结果，以1/v对对1/S作图，即求出作图，即求出V与与Km值。