西南民族大学学生实习日记.doc
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西南民族大学 学生实习日记 教学单位： 生命科学与技术学院 级、专业： 2010 级动物医学 学生姓名： 马英俊 学生学号： 201031304048 实习类别： 毕业实习 实习单位： 动物医学实验室 起止时间： 2014/3/20-2014/5/1 2013－2014 学年第 2 学期 教务处制使用说明 一、本实习日记为参加我校各教学单位 按教学计 划要求 组织的各类实习的学生填写 二、实习学生应如实记录实习过程中主要工作、 学习、活动情况及心得体会等内容 三、实习类别 填写“课程实习”或“毕业实习” 四、实习日记填写次数根据实习情况而定 五 、实习 日记 作为评定学生实习成绩和实习总结 的重要依据 六 、本日记使用结束后由各教学单位存档备查西南民族大学学生实习日记 日期： 2014/4/13 工作、学习、活动 纪要 ： 学习跑 PCR、跑凝胶电泳技术 心得体会、存在问题、改进意见： 初次接触 PCR 扩增,第一次跑电泳， 兴趣甚浓所以对这些技术也很用心地去学习，并加以掌握虽然结 果并不是太合意，但是对这些过程都有了一个较为系统的了解大致 过程如下：以提取的产肠毒素大肠杆菌 DNA 为模板，用引物对AST 基因进行 PCR 扩增。
PCR 反应体系：上下游引物各 1µL （引物浓度 均为 10 μmol/L ） ，DNA 模板 1µL ，ddH 2 O 17.3 µL ，总体系为 25µL PCR 反应条件：95℃预变性 5min；变性 95℃、30s，65℃退 火、30s，延伸 72℃、45s，35 个循环； 最后 72℃延伸 5min PCR 扩增产物用 2% 琼脂糖凝胶电泳检测，并统计阳性结果在加体 系的时候要遵循先多后少的原则，减少误差至于配胶的时候，要注 意尽量将琼脂糖加热到透明状态给凝胶点样的时候要遵从“阴性第 一个加，阳性最后一个加，保证无污染”原则 日期： 2014/4/14 工作、学习、活动 纪要 ： 学习 RT—PCR 技术并总结出现的问题 心得体会、存在问题、改进意见： RT-PCR 的要求有： 1.做 RT 前必需检测 RNA 的完整性和 RNA 浓度，逆转录体系对 RNA 量还是有一些要求，常用 500 ng 或 1 ug2.RT 按要求做，一般不会出太大问题 3.PCR，按常规但如需扩长片段，则对前两步要求较高，需要有 完整的 cDNA 存在 出现问题可能的原因： 1.总 RNA 质量不好。
在所有 RNA 实验中，最关键的因素是分离得到 全长的 RNA而实验失败的主要原因是核糖核酸酶（RNA 酶）的污 染由于 RNA 酶广泛存在而稳定，一般反应不需要辅助因子因而 RNA 制剂中只要存在少量的 RNA 酶就会引起 RNA 在制备与分析过 程中的降解，而所制备的 RNA 的纯度和完整性又可直接影响 RNA 分 析的结果，所以 RNA 的制备与分析操作难度极大在实验中，一方 面要严格控制外源性 RNA 酶的污染；另一方面要最大限度地抑制内 源性的 RNA 酶RNA 酶可耐受多种处理而不被灭活，如煮沸、高压 灭菌等外源性的 RNA 酶存在于操作人员的手汗、唾液等，也可存 在于灰尘中在其它分子生物学实验中使用的 RNA 酶也会造成污染 这些外源性的 RNA 酶可污染器械、玻璃制品、塑料制品、电泳槽、 研究人员的手及各种试剂而各种组织和细胞中则含有大量内源性的 RNA 酶 2.引物设计的问题 3.PCR 条件的优化西南民族大学学生实习日记 日期： 2014/4/15 工作、学习、活动纪要： PCR 检测 AST 毒力基因 心得体会、存在问题、改进意见： 这一次还是按照原来的体系加样， 按照原来的程序跑 PCR ，跑电泳。
可是结果却很难看之所以跑不出 结果，我总结原因如下：根据出现的纹路条带来看，可能是时间太久了的缘故因为我是用 电压 100v；电流 90MA 跑的电泳但是过了 50 分钟的时间之后我 才去照胶并且从 markⅠ的片段来看，确实是跑过度了这次实验告 诉我一定要把握好时间，一般蓝色条纹到了第三个格差不多就可以去 照胶了平时使用 85v 电压、85MA 电流跑电泳一般能跑出很不错的 结果 日期： 2014/4/16 工作、学习、活动纪要： 学习和掌握生化试验 心得体会、存在问题、改进意见： 细菌的生化反应是指各种微生物生 化试验方法原理 通常利用生化试验的方法，检测细菌对各种物质的 代谢作用及其代谢产物，常用于细菌的鉴别主要通过以下试验方法 进行鉴定： 1、 糖类分解产物 （1）糖发酵试验（carbohydrate fermentation test） ；（2）VP 试验 （Voges-Proskauer test） ；（3）甲基红试验（methyl red test ） ；（4）枸橼酸盐利用试验(citrate utilization test） 2、蛋白质及氨基酸的分解产物 （1）硫化氢试验（hydrogen sulfide test ） ；（2）明胶液化试验； （3）吲哚试验（indole test ） 。
西南民族大学学生实习日记 日期： 2014/4/17 工作、学习、活动纪要： astA 毒力基因的检测 心得体会、存在问题、改进意见： 这些天几乎每天都在跑 PCR，每天 都要跑电泳，但是每天的收获是不一样的这段时间以来，一开始觉 得无论是 PCR 还是电泳都是高大上的技能，现在觉得其实也就是那 么一回事，不过就是一项很机械也很简单的实验技能罢了之前我连 照图都不会，现在觉得照图其实挺简单的，前提是只要机器不出问题 这一次跑的结果很不错，可以说是得益于这些天的失败吧，不得不说 失败确实是成功之母呀 日期： 2014/4/18 工作、学习、活动纪要： 学习和掌握鉴定生化结果原理 心得体会、存在问题、改进意见： 1、 糖类分解产物 （1）糖发酵 试验 不同种类的细菌对糖的分解利用能力不同，一般以能否分解某 种糖，是否产酸产气等现象来鉴别例如大肠杆菌能分解葡萄糖和乳 糖，产酸且产气；这是因为大肠杆菌分解葡萄糖等产生甲酸，经甲酸 解氢酶的作用生成 H2 和 CO2 （2）VP 试验 产气杆菌将分解葡 萄糖产生的两分子丙酮酸脱羧，生成一分子乙酰甲基甲醇乙酰甲基 甲醇在碱性溶液中被空气中氧气氧化，生成二乙酰，二乙酰可与培养 液中含胍基的化合物（如蛋白胨中的精氨酸）反应，生成红色的化合 物，此为 VP 试验阳性。
大肠杆菌分解葡萄糖不生成乙酰甲基甲醇， 故 VP 试验阴性 （3）甲基红试验 大肠杆菌属 G- 短杆菌，能分解葡萄糖、乳糖产酸产气大肠杆菌可产生甲酸、乙酸、乳酸、琥珀酸 等，故大肠杆菌培养液 PH 在 4.5 以下，加入甲基红指示剂呈红色， 为甲基红试验阳性； （4）枸橼酸盐利用试验 产气杆菌在以枸橼 酸盐为唯一碳源的培养基上生长，分解枸橼酸盐产生 CO2，并转变为 碳酸盐，使培养基由中性变为碱性，含溴麝香草酚蓝（BTB）指示剂 的培养基由淡绿色变为深兰色，此为枸橼酸盐利用试验阳性大肠杆 菌不能利用枸橼酸盐，故在此培养基上不能生长，培养基仍为绿色 2、蛋白质及氨基酸的分解产物 （1）硫化氢试验 有些细菌能分解 培养基中的含硫氨基酸（如胱氨酸、甲硫氨酸等）产生 H2S ，如遇醋 酸铅或硫酸亚铁，能生成黑色的硫化物，为硫化氢试验阳性本试验 常用于区别肠道杆菌的种类沙门氏菌属通常为阳性;大肠杆菌、产气 杆菌、志贺氏菌为阴性 （2）明胶液化试验 有些细菌具有明胶酶， 能分解明胶使其失去凝固能力而液化变形杆菌、霍乱弧菌、绿脓杆 菌、枯草杆菌等能液化明胶；大肠杆菌、沙门氏菌则不能 （3） 吲哚试验 有些细菌含有色氨酸酶，能分解蛋白胨中的色氨酸生成无 色吲哚，加入对-二甲基氨基苯甲醛，无色吲哚生成红色玫瑰吲哚， 为吲哚试验阳性。
大肠杆菌、霍乱弧菌等吲哚试验阳性；产气杆菌、 伤寒沙门氏菌为吲哚试验阴性西南民族大学学生实习日记 日期： 2014/4/26 工作、学习、活动纪要： 实习总结 心得体会、存在问题、改进意见： 本试验对分离自四川甘孜州和 阿坝州两藏区牦牛腹泻样品中的 ETEC 毒力基因进行检测，黏附素、 肠毒素、溶血素是 ETEC 致病因子[4]黏附素主要由 K99、K88、987P、F41 等菌毛基因编码，其中 K99 的分布最为广泛， 且为牛、羊、猪等牲畜所共有[5] 本试验中，41 株 ETEC 中均携带 有 K99 菌毛基因，未检测到其他三种菌毛基因溶血素基因虽为肠出 血性大肠杆菌（EHEC)的靶基因之一[6] ，但也存在于 ETEC 菌株 [7] ， Smith 在 1967 年报道大肠杆菌的溶血性可遗传转移，试验结果显示溶 血性大肠杆菌的靶基因 HlyA 在本次鉴定的牦牛源 ETEC 中的携带率 高达 37%（15/41) ，与相关报道一致astA 基因主要分布在肠致病性 大肠杆菌中[8]，在产志贺毒素大肠杆菌中有检出[9] ，但在本试验的产 肠毒素性大肠杆菌中也有检出，且检出比例高本试验对牦牛腹泻样 品中分离的 ETEC 的血清型和毒力基因的研究丰富了大肠杆菌的毒力 基因研究的相关资料，为进一步研究牦牛源 ETEC 的致病机理和防治 措施提供了一定的理论依据。
PCR 检测与其他感染性疾病诊断方法 相比,具有更高的特异性和敏感性.在实际应用中如何防止环境中的细 菌污染,避免出现假阳性结果是成功的关键我们在实验过程中每一环 节都严格无菌操作,尽量使用一次性耗材,所用试剂均经高压处理,并且 每次实验均设置了阴性对照,从而成功地避免了污染的发生。
