实验三.血浆蛋白结合率的测定.doc

院系：理学院 专业：农药学 学号：09310110020 姓名：王熠实验三：血浆蛋白结合率的测定1、实验目的测定磺胺嘧啶钠在不同动物体内的血浆蛋白结合率2、实验原理将蛋白置于一个隔室内，用半透膜将此隔室与另一隔室隔开蛋白等大分子不能通过此半透膜，但系统中游离配基可自由通过当达到平衡时半透膜两侧自由配基的浓度相等若系统中自由配基的总量已知，测定不含蛋白隔室中自由配基的浓度，即可推算与蛋白结合的配基量具有游离氨基的磺胺药在酸性介质中与亚硝酸发生重氮化反应后，可与 N-(1 萘基）乙二胺产生偶合反应生成紫红色偶氮染料，与经过同样处理的磺胺药标准液比较，用 721 分光光度计比色法测出组织中和不同时间的血液中磺胺嘧啶浓度由于亚硝酸不稳定，在实验中，用三氯醋酸与亚硝酸钠反应制的得剩余的过量亚硝酸影响测定，用氨基磺酸胺分解除去3、实验材料1、实验动物兔子一只2、设备与器械712 分光光度计、 管状半透膜（周长 5cm，长约 12cm） 、 丝线 、广口瓶 、 移液器 3、药物与试剂10%磺胺嘧啶钠注射液15%三氯醋酸溶液0.1%亚硝酸钠溶液0.5%氨基磺酸胺溶液0.1%二盐酸 N-（1 萘基） -乙二胺溶液磺胺嘧啶钠贮存标准液磺胺嘧啶钠应用标准液4、试验方法1、试剂的制备0.1%二盐酸 N-（1 萘基） -乙二胺溶液：0.5 g 溶于 95 %乙醇约 400 mL 中，再用乙醇稀释至 500ml，棕色瓶于冰箱中保存透析液（PBS）：pH7.4 的 0.02M 磷酸盐缓冲液，内含 0.15M NaCl磺胺嘧啶钠应用标准液：10%磺胺嘧啶钠注射液 3.75μl 溶于约 80ml3%三氯醋酸溶液再定容于 100ml 容量瓶中备用2、血浆制备兔心脏采血，肝素抗凝，以 3000rpm 离心 10min，取上清液即为血浆。

3、透析将管状半透膜一端折叠，用纱线扎紧，保留结扎线段 10cm 左右，以调节袋内外液面在同一水平，加血浆样品 2.0ml 于上述半透膜袋内，并扎紧口袋另一端，袋口不得污染血浆将两端扎紧的半透膜置于盛有 9.75ml 透析液的30ml 广口瓶中，用袋两端线段调节袋内外液面，加 0.05mg/ml 的磺胺嘧啶钠溶液 0.5ml 于各瓶袋外透析液中置广口瓶于冰箱中，平衡透析约 60h 左右吸出袋外透析液少许，加等量磺基水杨酸试剂，无浑浊，说明无血浆蛋白漏出取出半透膜，用滤纸吸干袋外壁透析液，小心解开透析袋，使袋内血浆流入干净试管4、用重氮化-偶合比色法测定袋内外溶液中磺胺药浓度取袋内外溶液各 0.5ml，加水 15.5ml；加 15%三氯醋酸 4ml，混匀，静置2min，过滤，取试管 3 支，各加入滤液 5mL，为测定管；取试管 3 支，加入空白对照液 5mL，为空白管；取试管 3 支，加入应用标准液 5mL，为标准管，在以上各管中各加入 0.1%亚硝酸钠溶液 0.5mL，混匀，放置 3min，各加入 0.5%氨基磺酸胺溶液 0.5mL，混匀，放置 2min ，各加入 0.1%二盐酸 N-（1 萘基）-乙二胺溶液 2.5mL，充分混匀，放置 10min，用 721 分光光度计在 550nm 波长处比色：以空白管校正光密度到 0 点，读取标准管和测定管光密度，并用公式计算：测定管光密度游离磺胺药含量 （mg%）= —————— × 应用标准液浓度 ×样品稀释倍数 标准管光密度5、计算血浆蛋白结合率。

Dt - Dffb= --------------×100% Dtfb：血浆蛋白结合率；Dt：血药总浓度（透析袋内血浆药物浓度） ；Df：游离药物浓度（透析袋外缓冲液中药物浓度）五、实验结果1、结果记录表一：标准管和测定管光密度的测定结果样一 样二 样三 平均值透析袋外 0.006 0.008 0.011 0.008透析袋内 0.065 0.090 0.061 0.072标准液 0.690 0.701 0.680 0.6902、游离磺胺药含量的计算计算得：透析袋内药物浓度=0.000044mg/ml透析袋外药物浓度=0.00039mg/ml3、药物血浆蛋白结合率的计算结果：兔：fb=88.9%六、结果讨论与总结1、分光光度计的使用操作由于应该使用一套比色杯来测定吸光度，而在实际操作中比色杯使用混乱，而且并没有做到严格的润洗，所以吸光度的测量存在较大的误差。

分光光度计的使用应该注意的事项： （1）为了防止光电管疲劳不测定时必须将比色皿暗箱盖打开，使光路切断，以延长光电管使用寿命2）拿比色皿时，手指只能捏住比色皿的毛玻璃面，不要碰比色皿的透光面，以免沾污3）清洗比色皿时，一般先用水冲洗，再用蒸馏水洗净每次做完实验时，应立即洗净比色皿4）测定有色溶液吸光度时，一定要用有色溶液洗比色皿内壁几次，以免改变有色溶液的浓度另外，在测定一系列溶液的吸光度时，通常都按由稀到浓的顺序测定，以减小测量误差5）在实际分析工作中，通常根据溶液浓度的不同，选用液槽厚度不同的比色皿，使溶液的吸光度控制在 0.2～0.72、总结动物的种属、生理病理状态、个体差异可以影响血浆蛋白结合率理论上当蛋白浓度足够高时所有与蛋白作用的药物都能被结合但实际情况下，当亲和力较低时不可能达到这种所谓的足够高的蛋白浓度蛋白浓度一定时，一定范围内当药物浓度增加结合的药量会随之增加，但结合分数降低相反，当药物浓度下降时，结合分数增加并逐渐趋向于一个最大值, ，因此不同药物在低浓度时的最大结合率各不相同平衡透析法是一种相对简单不需要复杂设备的可行性强的操作方法实验过程中所用三角瓶、移液管、试管等并没有经过彻底清洗会对实验结果造成影响，不同的动物种类以及相同的动物的个体差异会对实验结果造成影响，还有操作人员的失误也会对实验结果造成影响，药物浓度和血浆蛋白浓度对结合率都有影响。

在报导血浆蛋白结合率时，必须同时注明实验过程中所用的药物浓度和蛋白浓度。