第十八章蛋白质组研究中的翻译后修饰.pdf

第十八章 蛋白质组研究中的翻译后修饰分析第一节 磷酸化蛋白质组研究一 介绍蛋白质磷酸化研究是一项大事业 在生命现象的很多关键调节机制中 蛋白质的磷酸化是最重要的翻译后修饰 20 世纪 50 年代 发现磷酸化酶 a 和磷酸化酶 b 原来是同一种酶的磷酸化和脱磷酸化形式 从那时开始 生物学家开始将蛋白质的磷酸化看作是一种动态的生物调节过程 [1] 在原核生物中磷酸化位点主要位于组氨酸 谷氨酸和天冬氨酸残基但在真核生物中的磷酸化主要发生在丝氨酸 苏氨酸和酪氨酸残基 [2] 从 50 年代后的几十年里 磷酸化蛋白质的研究一直受到生物学家的广泛重视 重大的研究成果屡见不鲜 但是 传统的磷酸化分析依赖于放射性同位素标记 Edman 降解以及薄层层析等方法 [2] 这些方法冗长 需要高超的实验技巧和较多的蛋白质 而且对操作者存在放射性危险 [3]20 世纪 80 年代 蛋白质的分析遇到了最重要的一次技术革命 电喷雾 第一种可以运用于生物大分子的质谱电离方式诞生了 随后 基质辅助激光解析电离也运用于蛋白质的分析 质谱分析成为蛋白质分析领域的中坚力量 当然的 作为蛋白质分析新宠的质谱技术 也被大量的应用于磷酸化蛋白质的检测90 年代后 质谱技术的发展迎来了历史上最好的阶段 世界各个工业科技强国投入大量精力 开发质谱技术 各种类型的质谱纷纷出现 如 MALDI-TOF MALDI-QTOFMALDI-TOF-TOF MALDI-ION-TRAP ESI-ION-TRAP ESI-Q-TOF 三级四级杆质谱和即将成为质谱技术先锋的 FTICR 本文将就使用现代质谱技术对真核生物蛋白质磷酸化的分析检测及磷酸化蛋白质组研究的策略进行综述(一 ) 概况蛋白质磷酸化在真核生物中是非常重要 而且是非常普遍的现象 据估计 在任一给定时刻 细胞内约有三分之一的蛋白质存在磷酸化 [4] 在真核生物常见的三种磷酸化形式中 丝氨酸磷酸化最多 苏氨酸磷酸化其次 而酪氨酸磷酸化最少 [5] 三者的比例是 1800200 1 磷酸化对于蛋白质而言是非均一性的 大多数磷酸化蛋白质都有多个磷酸化位点但这并不意味着某一蛋白质分子的所有潜在的磷酸化位点都是磷酸化的 [6] 人类的基因组中有 2%的序列用来编码磷酸化蛋白质 主要是蛋白质激酶和磷酸酯酶 其中丝氨酸和苏氨酸激酶的数量是酪氨酸激酶的四倍 而它们的磷酸酯酶的数量基本相同 [3]想要对蛋白质磷酸化进行分析 首先要对蛋白质磷酸化的化学有所了解 丝氨酸和苏氨酸磷酸化是不稳定的 在碱性条件下 磷酸基团会脱去 发生 消除 (图 18.1) 酪氨酸的磷酸化由于磷酸基团连在苯环上 不会发生 消除 相对是较稳定的 丝氨酸和苏氨酸残基上磷酸基团脱去后的质量变化与酪氨酸是不同的 (图 18.2) 酪氨酸因为无法进行 消除反应 所以在质量变化上比丝氨酸和苏氨酸少一步 质量的减少是 80Da 而不是 98Da这些细节的质量变化是磷酸化质谱检测中所必须注意的分析蛋白质磷酸化是困难的 尽管现代质谱技术的发展非常迅猛 但是磷酸化面临的难点仍然存在 详细分析起来 难点如下 首先 磷酸化蛋白质在细胞内的蛋白质中是相对较低丰度的 第二 即使我们找到一种磷酸化蛋白质 也不能排除有该蛋白质的其他磷酸化形式存在 在体内磷酸化与其说是一座 山 (静态 ) 不如说是一条 河 (动态 ) 第三 细胞内有很多磷酸酯酶 在样品处理时 这些酶很容易将磷酸基团脱掉 因此 在处理样品时 加入磷酸酯酶抑制剂是非常必要的 [6] 第四 磷酸化蛋白质酶解后的磷酸化肽段 因为其化学性质的负电性 在质谱技术中面临着难以质子化的困难 此外 磷酸化肽段在质谱图谱中还往往会受到非磷酸化的肽段信号的强烈抑制 这一点在 MALDI 源的质谱中尤为明显 [7,8]磷酸化研究对于蛋白质组来说是重要的 尽管有着上述的种种困难 各国学者仍然努力开发了研究它的方法 下面本文会就克服以上困难的各种方法作综述图 18.1 丝氨酸和苏氨酸磷酸化的不稳定性 (R=H CH3)磷酸基团在碱性环境下易于脱去 并伴随着 消除反应 再脱去一分子水(二 ) 富集的策略磷酸化蛋白质的丰度低 而且磷酸化肽段分析检测的困难 使得富集在磷酸化蛋白质组的研究中显得十分重要 富集的策略应用在磷酸化蛋白质组研究中 有两种不同的应用阶段 富集磷酸化蛋白质和富集磷酸化肽段1 磷酸化蛋白质的富集这一类富集策略的目标是磷酸化的蛋白质 富集这些蛋白质的主要的手段是 使用磷酸化蛋白的抗体 磷酸化蛋白质的抗体 主要分成两种 一种是丝氨酸和苏氨酸磷酸化蛋白质的抗体 另一种是酪氨酸磷酸化蛋白质的抗体 其中 酪氨酸磷酸化抗体应用的较早很早就有专一性强 效率高的抗体存在 因此也就较早的可以用于免疫共沉淀 [9] 最近已经有可用于丝氨酸和苏氨酸磷酸化的抗体面世 这些抗体不但可以用于 western blotting检测 还可以用于免疫共沉淀纯化磷酸化蛋白质 无疑这将大大方便免疫共沉淀在磷酸化蛋白质的富集中的应用 [6]同样是富集磷酸化蛋白质 也有使用化学方法进行修饰 改变磷酸基团的化学性质然后特异性的分离纯化 并可以定量的分析这些磷酸化蛋白质 [10-12] 这些方法无一例外的涉及到化学修饰的效率问题 在试验中的蛋白质损失是难免的 这也间接的影响了此类方法的应用 其中一种化学修饰的基础是利用磷酸基团脱去后的 消除反应 通过加成反应共价连接新的化学修饰基团 消除反应后生成的脱氢氨基酸直接由质谱检测 (MS/MS)或用 EDT (Ethanedithiol)作为亲核试剂 提供一个新的巯基以便连接一个生物素的亲和标签 为下一步的亲和纯化和同位素标记定量 (ICAT)提供条件 [11,13] 肽段中的半胱氨酸和甲硫氨酸会和 EDT发生付反应 因此首先要对这两种残基进行强烈氧化 使其丧失活性 GosheMB等人使用同位素标记的 EDT 这提供了一个巧妙的解决磷酸化肽段定量问题的方案 [12](如图 18.3所示 ) 这种化学方法的优点是所有的反应都在同一个反应体系内进行 没有很多的反应步骤 反应的产率有一定的保证 其缺点是一目了然的 它对于酪氨酸的磷酸化是无能为力的CNHCHOPOOHOHCO...H...R -H3PO4BaseN CH...CHCO...R第二种化学修饰是第一种方法的合理补充 它可以应用于酪氨酸磷酸化的检测 这种方法在保护肽段的氨基和羧基端的基础上 对磷酸基团进行化学修饰 然后用特异化学表面的微球纯化 但是很明显这一方法的化学基础是复杂的 其核心是对磷酸基团的修饰以便和有特异化学表面的玻璃珠结合纯化 这一方法的缺点是化学步骤太多 产率相对较低 这一点连作者本人都不否认 [10] 详细化学过程见图 18.42 磷酸化肽段的富集策略磷酸化蛋白质组研究中应用的抗体只是对磷酸化蛋白质有效 对磷酸化肽段进行富集使用较多的是固定金属鳌和亲和层析 (Immobilized metal affinity chromatography IMAC)图 18.2 氨基酸残基上的磷酸基团脱落时发生的结构变化和质量变化磷酸化酪氨酸残基因为结构的制约 不能象磷酸化丝氨酸和苏氨酸那样发生 消除反应 因此质量数变化只有 80Da 而一般磷酸化丝氨酸和苏氨酸的质量数变化有 98Da这项技术从 20世纪 90年代开始应用于磷酸化肽段的检测 在 online和 offline两个形式上都得到了满意的结果 [14-19] IMAC技术是用于富集磷酸化的肽段 对磷酸化蛋白质的富集是无效的 IMAC技术使用的金属离子主要是 Fe3+和 Ga3+ 据文献 [16]所说 Ga3+的富集效果比较Fe3+要好 但是本实验室的实践和后续的文献报道 [20]显示 Fe3+的效果是可以接受的 而且由于 Fe3+便宜和易于操作的优点 比 Ga3+的应用要广泛些蛋白质组学的开展 需要有大规模 自动化的技术 对 IMAC技术的要求也是如此尽管有报道 在 offline条件下的磷酸化肽段纯化有良好的结果 但是从长远来看 IMAC参与其中的多维色谱技术的发展是必须的 在这一点上 已经有不错的进展 Zarling AL等人在 2000年作了报道 他们使用内径 100 m的 IMAC柱 ,与两根反相柱联用形成多维色谱 取得了良好的试验效果 [21] 之后不久 在 Nature biotechnology上 就报道了更出色的工作 [20]COCHCH2NCCHCHCHCCHOH......POHOHO-HPO3CCHCH2NCCHCHCHCCHOHOH......-80DaltontyrosineCHCCHNOOH......POHOHOR-H3PO4-98DaltonCCOCHNRH...... (R=CH3or H)phosphoserine or phosphothreoinephosphotyrosine在使用基本相同的技术手段的情况下 在酵母的全细胞裂解液中检测到了超过 1 000个磷酸化肽段 并分析了其中的一部分IMAC 柱富集磷酸化肽段的原理是 利用了磷酸基团的负电性 与 IMAC 柱上的带正电的金属离子结合 从而起到纯化的作用 IMAC 技术对丝氨酸 苏氨酸和酪氨酸磷酸化都有效 但是 IMAC 柱上的正电荷位点同样会与肽段中的天冬氨酸 谷氨酸和组氨酸残基结合 从而特异性和非特异性肽段同时富集 所以 IMAC 方法面临的最主要的缺点是特异性不强 最近 在上述同一篇文献中 对磷酸化肽段中的酸性残基进行了预先的甲基酯化封闭了上述氨基酸的酸性侧链 从而大大的提高了 IMAC 方法的特异性 [20] 这一方法弥补了 IMAC 技术最大的缺陷 给大规模磷酸化蛋白质组学的开展带来了美好的前景磷酸化蛋白质和肽段的富集对于它们的检测是重要的 进行磷酸化蛋白质组研究 第一步要做的就是富集 以上介绍的这两方面的集策略 各有各的优缺点 笔者认为 以抗图 18.3 通过同位素标记的化学修饰进行丝氨酸和苏氨酸磷酸化肽段的富集和定量体为基础的第一种策略是有效的但是昂贵的 现阶段酪氨酸磷酸化蛋白质的抗体比丝氨酸和苏氨酸的要有效些 对于大多数国内实验室来说 受财力所限使用时会有些困难 而以HCCNOH... ...CHOPO-O- OXOH -P043-Beta-EliminationCCNCHH O......XH+-SCL2CL2S- L是氢或是氘Michael AdditionCCNH......OCHHSCCS-XL2L2R ICCNH......OCHHSCCSXL2L2RBiotinyalationI-Note: 1. X=CH3,H2. R=CH2CH2CH2CH2CNHCH2CH2OCH2CH2OCH2CH2NHCCH2OOCHCCCH2SNHC NHOHH.色谱方法为基础的 IMAC 方法 同样是有效的 甚至于在有化学修饰辅助下是更有效的 [20]重要的是它的试验花费和前者相比是微不足道的 因此会有更好的应用 本实验室的实践证明在国内现有的条件下 使用相对简单的 IMAC 色谱柱对磷酸化肽段的富集也能得到满意的结果图 18.4 化学修饰后进行磷酸化蛋白质的纯化 (碳化二乙胺反应 )(三 ) 磷酸化肽段的质谱检测当代质谱技术沿着两条主线发展 其一是离子源 其二是检测器 这两个方向上几乎包括了所有新的技术思路 就离子源而言 自从上世纪八九十年代发明 ESI 和 MALDI 后鲜有质的突破 时至今日 绝大多数生物质谱的离子化方式仍然是这两种 而就质量分析器而言 种类倒是颇多 有经典的三级四级杆 离子阱和飞行时间检测器 也有稍后的Qq-TOF TOF-TOF 和即将成为热门的 FTICR 近几年来 质谱技术的发展主要集中在各种离子源和检测器 检测器和检测器的 杂交 上 产生了多种新颖的生物质谱 应用于生物学各个领域 本文以下将以生物质谱的这些技术特征为类 分别介绍应用于蛋白质组磷酸化研究的情况1 以 MALDI 为离子源以 MALDI 为离子源的生物质谱在通过 PMF(P。