实时荧光定量PCR具体实验步骤.docx

实时荧光定量PCR具体实验步骤实时荧光定量PCR操作步骤以下实验步骤仅供参考：1样品RNA的抽提① 取冻存已裂解的细胞，室温放置5分钟使其完全溶解② 两相分离 每1ml的TRIZOL试剂裂解的样品中加入0.2ml的氯 仿，盖紧管盖手动剧烈振荡管体15秒后，15到30°C孵育2到 3分钟4C下12000rpm离心15分钟离心后混合液体将分为 下层的红色酚氯仿相，中间层以及无色水相上层RNA全部被分 配于水相中水相上层的体积大约是匀浆时加入的TRIZOL试剂 的60%③ RNA沉淀 将水相上层转移到一干净无RNA酶的离心管中加 等体积异丙醇混合以沉淀其中的RNA，混匀后15到30C孵育10 分钟后，于4C下12000rpm离心10分钟此时离心前不可见的 RNA沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块④ RNA清洗移去上清液，每1mlTRIZOL试剂裂解的样品中加入 至少1ml的75%乙醇（75%乙醇用DEPCH O配制），清洗RNA沉淀2混匀后，4C下7000rpm离心5分钟⑤ RNA干燥小心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉淀在室温空气 中干燥5-10分钟⑥ 溶解RNA沉淀 溶解RNA时，先加入无RNA酶的水40 u l用枪 反复吹打几次，使其完全溶解，获得的RNA溶液保存于-80C待 用。

1 / 301） 紫外吸收法测定先用稀释用的TE溶液将分光光度计调零然后取少量RNA溶液 用TE稀释（1:100）后，读取其在分光光度计260nm和280nm处 的吸收值，测定RNA溶液 浓度和纯度① 浓度测定A260下读值为1表示40 Pg RNA/ml样品RNA浓度（Pg/ml）计算 公式为：A260 X稀释倍数X 40 Pg/mlo具体计算如下：RNA 溶于 40 Pl DEPC 水中，取 5ul, 1:100 稀释至 495P1 的 TE 中，测得 A260 = 0.21RNA 浓度=0.21 X100 X40Pg/ml=840Pg/ml 或 0.84Pg/Pl 取5ul用来测量以后，剩余样品RNA为35 Pl,剩余RNA总量为:35 Pl X 0.84 Pg/Pl = 29.4 Pg② 纯度检测RNA溶液的A260/A280的比值即为RNA纯度，比值范围1.8到2.12） 变性琼脂糖凝胶电泳测定① 制胶1g琼脂糖溶于72ml水中，冷却至60°C, 10 ml的10X MOPS电 泳缓冲液和18 ml的37%甲醛溶液（12.3 M）10XMOPS电泳缓冲液浓度 成分0.4M MOPS，pH 7.00.1M 乙酸钠0.01M EDTA 灌制凝胶板，预留加样孔至少可以加入25 M溶液。

胶凝后取下 梳子，将凝胶板放入电泳槽内，加足量的1XM0PS电泳缓冲液至 覆盖胶面几个毫米② 准备RNA样品取3PgRNA，加3倍体积的甲醛上样染液，加EB于甲醛上样染液 中至终浓度为10Pg/ml加热至70°C孵育15分钟使样品变性③ 电泳上样前凝胶须预电泳5min，随后将样品加入上样孔5 - 6V/cm 电压下2h，电泳至溴酚兰指示剂进胶至少2 - 3cm④ 紫外透射光下观察并拍照28S和18S核糖体RNA的带非常亮而浓（其大小决定于用于抽提 RNA的物种类型），上面一条带的密度大约是下面一条带的2倍 还有可能观察到一个更小稍微扩散的带，它由低分子量的 RNA（tRNA和5S核糖体RNA）组成在18S和28S核糖体带之间可 以看到一片弥散的EB染色物质，可能是由mRNA和其它异型RNA 组成RNA制备过程中如果出现DNA污染,将会在28S核糖体RNA 带的上面出现，即更高分子量的弥散迁移物质或者带，RNA的降 解表现为核糖体 RNA 带的弥散用数码照相机拍下电泳结果3 样品 cDNA 合成① 反应体系序号 反应物 剂量1逆转录 buffer2ul2上游引物0.2ul3下游引物0.2ul4dNTP 0.1ul5逆转录酶 MMLV0.5ul6DEPC 水5ul7RNA 模版2ul8总体积10ul轻弹管底将溶液混合，6000rpm短暂离心。

② 混合液在加入逆转录酶MMLV之前先70°C干浴3分钟，取出后 立即冰水浴至管内外温度一致，然后加逆转录酶0.5ul, 37C 水浴 60 分钟③ 取出后立即95C干浴3分钟，得到逆转录终溶液即为cDNA溶 液，保存于-80C待用4梯度稀释的标准品及待测样品的管家基因（B-actin）实时定 量 PCR① B-actin阳性模板的标准梯度制备阳性模板的浓度为1011, 反应前取3ul按10倍稀释（加水27ul并充分混匀）为1010， 依次稀释至 109、108、107、106、105、104，以备用② 反应体系如下：标准品反应体系序号反应物 剂量1SYBR Green 1 染料l0ul2阳性模板上游引物F0.5ul3阳性模板下游引物R0.5ul4dNTP 0.5ul5Taq 酶 lul6阳性模板DNA 5ul7ddHO 32.5ul28总体积 50ul轻弹管底将溶液混合，6000rpm短暂离心管家基因反应体系：序号反应物 剂量lSYBR Green l 染料l0ul2内参照上游引物F0.5ul3内参照下游引物R0.5ul4dNTP 0.5ul5Taq 酶 lul6待测样品cDNA 5ul7ddHO 32.5ul28总体积 50ul轻弹管底将溶液混合，6000rpm短暂离心。

③ 制备好的阳性标准品和检测样本同时上机，反应条件为：93°C2分钟，然后93°C 1分钟，55°C 2分钟，共40个循环5制备用于绘制梯度稀释标准曲线的DNA模板① 针对每一需要测量的基因，选择一确定表达该基因的cDNA模 板进行PCR反应反应体系：序号 反应物 剂量1 10X PCR 缓冲液 2.5 ul2 MgCl 溶液 1.5 ul23 上游引物F 0.5 ul4 下游引物R 0.5 ul5 dNTP混合液 3 ul6 Taq聚合酶 1 ul7 cDNA 1 ul8 加水至总体积为 25ul轻弹管底将溶液混合，6000rpm短暂离心35个PCR循环（94C1分钟；55C1分钟；72C1分钟）；72°C延伸5分钟② PCR产物及DNA Ladder在2%琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染 色，检测PCR产物是否为单一特异性扩增条带③ 将PCR产物进行10倍梯度稀释：将PCR产物进行10倍梯度稀 释：设定PCR产物浓度为1X1010，依次稀释至109、108、107、 106、 105、 104几个浓度梯度6待测样品的待测基因实时定量PCR① 所有cDNA样品分别配置实时定量PCR反应体系。

体系配置如下：序号 反应物 剂量1 SYBR Green 1 染料 10 ul2 上游引物 1ul3 下游引物 1ul4 dNTP 1ul5 Taq聚合酶 2ul6 待测样品cDNA 5ul7 ddHO 30ul28 总体积 50 ul轻弹管底将溶液混合，6000rpm短暂离心② 将配制好的PCR反应溶液置于Real time PCR仪上进行PCR扩 增反应反应条件为：93°C2分钟预变性，然后按93°C 1分钟, 55°C 1分钟，72C1分钟，共40做个循环，最后72C7分钟延伸 7实时定量PCR使用引物列表引物设计软件：Primer Premier 5.0，并遵循以下原则：引物及 模板的序列紧密互补；引物及引物之间避免形成稳定的二聚体或 发夹结构；引物不在模板的非目的位点引发DNA聚合反应（即错 配）8电泳各样品的目的基因和管家基因分别进行Real time PCR反应PCR 产物及DNA Ladder在2%琼脂糖凝胶电泳，GoldView™染色，检 测PCR产物是否为单一特异性扩增条带实时荧光定量PCR组织RNA提取：一般认为lOOmg肝组织提取RNA 500ng , lOOmg肺提取RNA200ng，脑内的RNA丰度适中，lOOmg脑组织，提取RNA 5-200ng。

所以一个10mg的海马可匀出RNA约为20ng反转录反应反转录反应参照TaKaRa RT-PCR说明书 反转录反应条件如下37° C 15 min （反转录反应）85° C 5 sec （反转录酶的失活反应）Real Time PCR 反应选用脑源神经营养因子（BDNF ）为目标基因，核糖体18S rRNA（18S rRNA）做为内参基因引物序列扩增片段长度NR2BNR2B（+）CCGCAGCACTATTGAGAACA213 bpNR2B（-）ATCCATGTGTAGCCGTAGCC18s18sTTTGTTGGTTTTCGGAACTGA198 bprRNArRNA(+)18srRNA(-)CGTTTATGGTCGGAACTACGA1）按下列组份配制PCR反应液（反应液配制请在冰上进行）试剂使用量终浓度Sybr® Premix Ex TaqTM (2X)12.5 ul1XPCR Forward Primer (10 u M)1 ul0.4 uMPCR Reverse Primer (10 u M)1 ul0.4 uM模板（cDNA溶液）0.5 uldH2O10 ulTotal25 ul全班40人，分为5组，每组做8管。

4管做BDNF, 4管做18S rRNA 4管BDNF或者18SrRNA，采用相应的正反PCR引物每种基因做两 个模板，一个模板采用原液浓度，一个模板采用稀释一倍浓度， 体积均为0.5 ul2）三步法PCR首先95° C作用3 minPCR进行35个循环步骤温度时间变性95° C30秒退火58°C30 秒延伸72°C30 秒融解曲线温度时间变温速度95° C0秒20° C/秒55°C15秒20° C/秒95°C0秒0.1° C/秒PCR 疑难解答当 PCR 结果不甚满意时，首先检查以下几方面并遵照执行：1 将 PCR 反应的试管及反应板紧贴2当酶反应混合物以70°C “热启动”开始循环时，切记在加入酶 后稍3微振荡一下，因为在0.2-ml的PCR管中不能均匀传热4 不要随意减少 dNTP 的用量，它是一个系统的因素，必须及其 它成份保持平衡5 对于有问题的 PCR 反应，例如模板的量少，模板不纯和环状模 板等，先尝试加 Taq 酶前的体系进行预变性，后加模板进行正常PCR 扩增没有扩增产物： 1在提供MgCl2缓冲液中，以0.25mmol/L为梯度增加MgCl2浓 度；无MgCl2的缓冲液以0.5 mmol/L为梯度增加MgCl2浓度。

2泳道中出现模糊条带，如果DNA模板中存在RNA，则按上述提 示浓度补加MgCl2,因为在PCR反应中可能缺少游离的Mg2+3 检查退火温度和变性条件，如果有需要的话，可降低退火温 度。