蓝耳病研究进展.ppt

猪繁殖与呼吸综合征病毒致病机理的研究进展郭￿天￿准文 献 导 读猪繁殖与呼吸综合征病毒致病机理的研究进展前 言1致病机理3小 结4生物学特性2猪繁殖与呼吸综合征病毒致病机理的研究进展1￿前￿￿言®猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)引起的一种以母猪繁殖障碍和仔猪呼吸道疾病为主要特征的病毒性传染病®临床特征主要表现为妊娠母猪发热、厌食，怀孕后期流产、早产，产弱仔、死胎和木乃伊胎；仔猪和育成猪则以呼吸系统疾病和高死亡率为特征由于发病后部分病猪耳部和躯体末端皮肤发绀，故又俗称为"蓝耳病"猪繁殖与呼吸综合征病毒致病机理的研究进展19871987年年 首次发现于美国首次发现于美国19911991年年 荷兰首次分离到该病毒，命名为荷兰首次分离到该病毒，命名为Lelystad virus(LV)19921992年年 美国分离到一株美国分离到一株PRRSV，命名为，命名为VR 2332毒株毒株19961996年年 郭宝清等首次从流产胎儿中分离到郭宝清等首次从流产胎儿中分离到PRRSV19951995年年 我国北京地区首次报道发生本病我国北京地区首次报道发生本病20062006年年 由该病毒变异株引起的由该病毒变异株引起的HP-PRRS在我国广泛流行在我国广泛流行猪繁殖与呼吸综合征病毒致病机理的研究进展®PRRSV在毒力、抗原性和遗传性等方面均有很大差异，根据基因序列及抗原性差异，可将PRRSV分为以LV为代表的欧洲型毒株和以VR 2332为代表的北美型毒株，目前我国流行毒株主要以北美型为主。

®PRRSV感染机体后，造成免疫细胞损伤，引发机体免疫抑制，同时还能够产生抗体依赖性增强作用(ADE)，从而导致病毒的持续性感染猪繁殖与呼吸综合征病毒致病机理的研究进展2￿生物学特性￿2.1￿病原学特征®PRRSV粒子呈球形或卵圆形，有囊膜，直径约为50~65nm，核衣壳直径约为25~35nm，呈二十面体对称，囊膜表面有纤突®PRRSV粒子对乙醚和氯仿等脂溶剂比较敏感病毒粒子热稳定性差，对高温、干燥条件特别敏感病毒在环境中可稳定存在，但pH高于7.5或者低于6.5时，病毒则很快失活注意：样品送检及病毒保存猪繁殖与呼吸综合征病毒致病机理的研究进展￿2.2￿基因组特征®PRRSV是单股正链RNA病毒，其基因组全长约15kb，具有5'端帽子结构和3'端有poly(A)尾，其基因组顺序为5'-ORF1a-ORF1b-ORF(2-6)-ORF7-3'，含有至少九个开放阅读框(ORF)，每个阅读框和相邻的阅读框都有部分重叠®研究发现了一个新的ORF，认为在病毒的复制和感染过程中发挥着重要作用，并将其命名为ORF5a猪繁殖与呼吸综合征病毒致病机理的研究进展￿2.2￿基因组特征®ORF1包括ORF1a和ORF1b，主要编码依赖于RNA的RNA聚合酶和复制酶。

®ORF2-ORF4主要编码病毒的次要结构蛋白，包括GP2、GP3、GP4和E蛋白，是糖基化的囊膜蛋白®ORF5、ORF6和ORF7分别编码病毒糖基化的囊膜蛋白(GP5)、膜基质蛋白(M)和核衣壳蛋白(N)，是病毒的主要结构蛋白细胞损伤机制细胞受体免疫抑制抗体依赖性增强作用持续性感染遗传变异3.13￿致病机理细胞损伤机制细胞受体免疫抑制抗体依赖性增强作用遗传变异持续性感染猪繁殖与呼吸综合征病毒致病机理的研究进展3.53.63.43.33.2细胞损伤机制细胞受体免疫抑制抗体依赖性增强作用遗传变异持续性感染猪繁殖与呼吸综合征病毒致病机理的研究进展猪繁殖与呼吸综合征病毒猪繁殖与呼吸综合征病毒通过通过呼吸道或或生殖道等途径等途径传播传播肺和淋巴结等组织的巨噬细胞肺和淋巴结等组织的巨噬细胞内增殖内增殖PAM和和PIM大量裂解死亡大量裂解死亡肺泡功能发生障碍肺泡功能发生障碍仔猪和育成猪表现仔猪和育成猪表现典型的呼吸道症状典型的呼吸道症状在血液巨噬细胞和单核细胞内增殖在血液巨噬细胞和单核细胞内增殖分布到全身各组织器官的巨噬细胞内分布到全身各组织器官的巨噬细胞内病毒血症及相应组织器官不同程度的损伤及相应组织器官不同程度的损伤血液循环及淋巴循环细胞损伤机制细胞受体免疫抑制抗体依赖性增强作用遗传变异持续性感染猪繁殖与呼吸综合征病毒致病机理的研究进展®感染细胞的凋亡感染细胞的凋亡®邻近非感染细胞的程序性死亡邻近非感染细胞的程序性死亡®诱导产生炎性细胞因子诱导产生炎性细胞因子®巨噬细胞吞噬清除功能减弱 导致PAM释放超氧负离子的能力降低，使其依赖于超氧负离子所发挥的非特异性杀菌作用的功能下降，从而容易继发感染其它细菌或病毒。

混合感染、疫情加重如PRRS病猪可继发感染副猪嗜血杆菌病、、猪链球菌病、、猪支原体肺炎、、猪伪狂犬病、、猪圆环病毒2 2型等疾病细胞损伤机制细胞受体免疫抑制抗体依赖性增强作用遗传变异持续性感染猪繁殖与呼吸综合征病毒致病机理的研究进展®病毒受体是决定病毒宿主范围和组织嗜性的重要因素，关于病毒受体特异性和病毒起源宿主类型之间关系的研究是目前病毒学研究的热点和难点之一®研究表明，PRRSV侵染猪肺泡巨噬细胞的先决条件是实现与细胞上的受体完成吸附，而这种吸附过程是PRRSV侵染靶细胞必不可少的细胞损伤机制细胞受体免疫抑制抗体依赖性增强作用遗传变异持续性感染猪繁殖与呼吸综合征病毒致病机理的研究进展®试验研究已经证实存在试验研究已经证实存在6种种PRRSV的细胞受体的细胞受体 硫酸乙酰肝素(heparin sulphate，HS) 唾液酸黏附素(sialoadhesin，Sn) CDl63分子(cluster of differentiation 163) 波形蛋白(vimentin) NMMHC IIA分子(非肌肉肌球蛋白重链ⅡA) CD151分子(cluster of differentiation 151)细胞损伤机制细胞受体免疫抑制抗体依赖性增强作用遗传变异持续性感染猪繁殖与呼吸综合征病毒致病机理的研究进展®硫酸乙酰肝素(heparin sulphate，，HS) 肝素、肝素酶或硫酸乙酰肝素类似物处理PRRSV，发现这些化学物质能明显抑制PRRSV对PAM或MARC-145细胞的感染，从而证实HS是PRRSV的一个细胞受体。

研究发现，PRRSV中以M-GP5复合物形式存在的病毒基质蛋白是HS受体的主要结合位点，参与PRRSV吸附到PAM，对感染过程十分重要，但主要发生在PRRSV的感染早期另外，PRRSV侵入PAM细胞的过程并不能被可溶性的HS单克隆抗体完全阻断，表明还存在其他细胞受体参与PRRSV的结合和侵入宿主细胞细胞损伤机制细胞受体免疫抑制抗体依赖性增强作用遗传变异持续性感染猪繁殖与呼吸综合征病毒致病机理的研究进展®唾液酸黏附素唾液酸黏附素(sialoadhesin，，Sn) 主要功能是介导病毒的内吞形成内吞小体，并与HS受体在病毒感染过程中发挥协同作用病毒的内吞不依赖于HS，但存在HS受体情况下Sn对病毒的结合与内吞更加容易，Sn可单独完成病毒的内吞®CDl63分子(cluster of differentiation 163) CD163主要作用可能是协助Sn内吞、病毒脱衣壳和基因组RNA释放到细胞质中进行复制细胞损伤机制细胞受体免疫抑制抗体依赖性增强作用遗传变异持续性感染猪繁殖与呼吸综合征病毒致病机理的研究进展®波形蛋白波形蛋白(vimentin) PRRSV感染PAM的过程有HS和Sn的参与，但Marc-145细胞作为PRRSV的靶细胞本身不表达HS和Sn，可见Marc-145细胞表面另有其他受体介导PRRSV感染。

通过研究发现了波形蛋白，该蛋白能与PRRSV的N蛋白结合而介导病毒的感染过程®CD151分子分子(cluster of differentiation 151) 通过制备CD151单克隆抗体进行PRRSV病毒阻断试验发现其能完全阻断PRRSV对Marc-145细胞的感染，证实CD151可能是PRRSV的细胞受体细胞损伤机制细胞受体免疫抑制抗体依赖性增强作用遗传变异持续性感染猪繁殖与呼吸综合征病毒致病机理的研究进展研究发现，在PRRSV入侵靶细胞过程还依赖于天冬氨酸蛋白酶E和胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶，但这些分子在感染过程中所发挥的作用还需进一步研究，并且还可能存在其他未知的侵入介体细胞损伤机制细胞受体免疫抑制抗体依赖性增强作用遗传变异持续性感染猪繁殖与呼吸综合征病毒致病机理的研究进展图图1 PRRSV与细胞与细胞受体结合受体结合入侵入侵肺泡巨噬细胞肺泡巨噬细胞模式图模式图细胞损伤机制细胞受体免疫抑制抗体依赖性增强作用遗传变异持续性感染猪繁殖与呼吸综合征病毒致病机理的研究进展®PRRSV主要通过以下途径抑制机体天然免疫和适应性免疫应答： 抑制巨噬细胞和树突状细胞等免疫细胞的功能 调节T细胞免疫 诱导调节性T细胞分化 影响细胞因子的释放 抑制I型干扰素的产生及IFN介导的信号通路等 延迟中和抗体产生细胞损伤机制细胞受体免疫抑制抗体依赖性增强作用遗传变异持续性感染猪繁殖与呼吸综合征病毒致病机理的研究进展N30N34N35N33N44N51"decoy epitope""neutralizing epitope"Signal peptideectodomainhypervariable region图图2 GP5结构示意图及可能的糖基化结构示意图及可能的糖基化位点位点细胞损伤机制细胞受体免疫抑制抗体依赖性增强作用遗传变异持续性感染猪繁殖与呼吸综合征病毒致病机理的研究进展®PRRSV主要结构蛋白GP5的胞外结构域有1个免疫显性表位(表位A)，它能够在感染早期诱导机体产生高水平的非中和抗体免疫反应，导致位于其下游的中和表位(表位B)减弱或被屏蔽，从而不能产生相应的免疫应答。

®中和表位内以及周围的糖基化位点对中和表位有屏蔽作用，因而延迟中和抗体的产生和逃避中和抗体细胞损伤机制细胞受体免疫抑制抗体依赖性增强作用遗传变异持续性感染猪繁殖与呼吸综合征病毒致病机理的研究进展®抗体依赖性增强作用(ADE) 大多数病毒感染宿主细胞时，其表面抗原与靶细胞膜上的特异性受体结合，并诱导机体产生中和抗体，通常这种特异性抗体可以与病毒抗原结合使其失去感染细胞的能力但当机体内中和抗体水平低于免疫保护水平(亚中和水平抗体)时，抗体可以与病毒结合形成抗原抗体复合物，协助病毒入侵靶细胞，使其复制和感染能力显著增强，导致病毒的持续性感染细胞损伤机制细胞受体免疫抑制抗体依赖性增强作用遗传变异持续性感染猪繁殖与呼吸综合征病毒致病机理的研究进展®猪群免疫弱毒苗时，免疫初期诱导产生的抗体水平较低，中和病毒的活性弱，此时抗体可能会对野毒株在猪体内的复制起到增强作用，从而影响疫苗的免疫保护效果®由此可见，PRRSV诱导产生的抗体在不同水平所发挥的作用不同，就像一把“双刃剑”这提示我们在研发疫苗时需要进行ADE评估，在疫苗免疫时能够快速产生高水平中和抗体，回避抗体介导的ADE作用，从而保证疫苗的安全有效。

细胞损伤机制细胞受体免疫抑制抗体依赖性增强作用遗传变异持续性感染猪繁殖与呼吸综合征病毒致病机理的研究进展 PRRSV在感染猪体后常会引起持续性感染，即病毒在感染猪体内和污染猪场内感染猪群中持续性存在®从流行病学角度：引种；水平传播和垂直传播；潜伏感染猪®从免疫学角度：免疫抑制；抗体依赖性增强作用；母源抗体水平低®从遗传学角度：抗原表位突变；基因重组细胞损伤机制细胞受体免疫抑制抗体依赖性增强作用遗传变异持续性感染猪繁殖与呼吸综合征病毒致病机理的研究进展细胞损伤机制细胞受体免疫抑制抗体依赖性增强作用遗传变异持续性感染猪繁殖与呼吸综合征病毒致病机理的研究进展®PRRSV基因组具有高度的变异性，不同基因型及相同基因型的不同分离株间的基因组遗传变异程度较为明显，进而导致毒力及抗原性的差异除了编码M蛋白和N蛋白的基因相对保守外，NSP2和ORF5基因在PRRSV基因组中的变异程度较高®大量研究表明，在流行毒株的中和表位存在突变，突变后可能会减弱病毒对中和抗体的敏感性，从而影响中和抗体与病毒的结合，导致病毒逃逸细胞损伤机制细胞受体免疫抑制抗体依赖性增强作用遗传变异持续性感染猪繁殖与呼吸综合征病毒致病机理的研究进展®PRRSV可引起猪群的持续性感染，这也为病毒的遗传变异提供了很好的机会和环境。

丹麦疫苗株返强现象和美洲非典型PRRS的发生表明PRRSV在猪体内持续感染的过程中发生变异®病毒基因组除了发生点突变和缺失外，还可能发生基因重组，但目前还没有研究证实两种不同基因型毒株同时存在是否会发生重组，从而产生毒力更强的新毒株猪繁殖与呼吸综合征病毒致病机理的研究进展3￿小￿￿结 目前，国内外学者对于猪繁殖与呼吸综合征病毒的致病机理进行了大量研究，但对于病毒逃逸宿主的免疫监视以及免疫抑制的分子作用机制等方面尚未研究清楚，病毒抗原表位基因突变在毒力变异中的作用还需要进一步探索研究，从而为研发新型疫苗、新型免疫佐剂以及抗病毒药物奠定坚实的理论基础猪繁殖与呼吸综合征病毒致病机理的研究进展研究思路：®制备单克隆抗体，研发抗独特型抗体疫苗®考虑对优势抗原的中和表位及糖基化位点进行修饰®运用分子标记及噬菌体展示技术研究病毒入侵机制猪繁殖与呼吸综合征病毒致病机理的研究进展问题：®感染PRRSV的妊娠母猪如何引起子宫内胎儿感染？因为抗体和病毒等大分子物质不能通过母猪的胎盘屏障，推测PRRSV可能由穿过胎盘屏障的单核细胞和巨噬细胞携带进入胎儿体内，从而引起胎儿感染PRRSV®如何做好ADE评估？PRRSV引发的抗体依赖性增强作用提示我们研发疫苗时需要进行ADE评估，回避抗体介导的ADE作用。

猪繁殖与呼吸综合征病毒致病机理的研究进展问题：®如何进行优势抗原的中和表位及糖基化位点修饰？囊膜蛋白GP3和GP5是PRRSV的主要保护性抗原，但是抗原性存在明显变异，而其他蛋白的免疫原性相对较弱，因此在抗原表位及糖基化位点的修饰策略上存在矛盾®我们实验室PRRSV研究方向？近年来，由于实验室研究课题的限制，对于PRRSV的关注较少目前，我们主要进行流行毒株的分离鉴定及遗传变异分析，是否还有其他研究方向？猪繁殖与呼吸综合征病毒致病机理的研究进展Thanks for your attention!。