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USP法定方法验证法定方法验证Validation of Compendial Validation of Compendial ProceduresProceduresQC·方法验证2009.12目录目录 法定方法的验证法定方法的验证USP<1225>USP<1225>与与ICH Q2ICH Q2（（R1R1）之间的关系）之间的关系鉴别测试的方法验证鉴别测试的方法验证杂质测试的方法验证杂质测试的方法验证含量测定的方法验证含量测定的方法验证方法验证汇总方法验证汇总课程目的课程目的•明确验证的目的•区分验证和确认的区别•描述不同分析方法验证需考虑的条件•能够开展鉴定各种所需性质的实验•能够使用Excel分析验证实验的数据•理解新方法验证与替代正式方法的验证这两者之间统计学上的本质差别法定方法的验证法定方法的验证PART I“验证验证”的定义的定义•“分析方法验证是一个通过实验室研究来证明程序的性能参数符合期望的分析应用要求的过程”—USP•“分析方法验证的目的是显示分析方法适用于它所期望的应用目的” —ICH•“方法验证是一个阐述分析方法适合于其使用目的的过程” —FDA•“…适合于它的使用目的适合于它的使用目的” —关于验证共同的主题验证：关键的第一步验证：关键的第一步•在验证开始阶段将待验证方法目的目的清晰的表达出来是十分必要的，例如：•<71>无菌测试：“下列程序适用于确定医药产品是否如所宣称的那样是无菌的，并符合各论中设定的无菌测定要求”•下段中表述“这些药典方法不是设计用来保证各批产品无菌或已灭菌。

相关产品灭菌或无菌过程的验证才是从根本上实现这一点的”•“分析程序的目标应能被很清晰地被理解，因为它将主导哪些验证参数需要被评估 —ICH验证实施条件的阐明验证实施条件的阐明•提供验证实施所需的条件是必要的，如果发现条件与方法所要求条件不一致时，应指出•例如：<1047>生物技术—衍生产品—测试 全蛋白质测试（Bradford测试）一节中提到硅玻璃因和染料结合而不能使用同样不同蛋白在相同量的条件下也会表现出不同的响应值验证参数验证参数•Accuracy 准确性•Precision 精密度•Specificity 专属性•Detection Limit 检测限•Quantitation Limit 定量限•Linearity 线性•Range 范围“确认确认”的定义的定义•<1225>:“…USP-NF所收载方法的使用者不需要验证这些方法的准确性和可靠性，但需要确认这些方法在实际使用条件下的适应性”•<1226>:“确认包括所涉及方法的性能参数，如那些在<1225>中描述的，是产生相关数据而不是重复验证目的” ——USP•“出现在USP中的方法被认为已验证，对于法定方法，厂家必须阐明该方法在实际使用情况下的状态” ——FDA确认的一般要求确认的一般要求•“尽管在确认法定方法在真实条件下使用时的适应性不要求进行完整的再验证过程，列在<1225>表2中的一些分析参数可以在确认过程中使用”•“特定方法的确认仅需要对被认为适宜的参数进行评估”小结小结•验证：“必须阐明方法适合于它使用目的的一个过程”•确认：“阐明通过已验证方法进行产品测试的条件确实适合于该已验证方法的过程”•待验证方法的目的应被清晰明确的阐述•验证实施的条件应明确提出•确认包括使用者决定哪些条件将被评估，选择适宜数据元素进行检查。

USP<1225>USP<1225>与与ICH Q2ICH Q2（（R1R1））之间的关系之间的关系PART II概述概述ICH：本文件呈现出作为在欧盟，日本和美国所提交注册文件其中一部分的分析：本文件呈现出作为在欧盟，日本和美国所提交注册文件其中一部分的分析方法验证文件中应考虑参数的讨论方法验证文件中应考虑参数的讨论USP：按照联邦食品、药品和化妆品法案501节，美国药典和国家处方集中的含量分析和质量标准构成了法定标准cGMP法规要求那些用于评估药物产品符合设定标准的测试方法，必须符合适当的准确性和可靠性标准方法提交方法提交ICH：无相关章节无相关章节USP：提交应包括• 客观阐述（需求，能力，优点）• 完整的程序描述，应足够详细以便于有经验丰富的人员能重复其程序和结果• 基于参数的数据，应包括实验数据总结和证实各个相关分析参数的计算等方法种类方法种类ICH：：• 鉴别测试鉴别测试• 杂质的定量分析杂质的定量分析• 杂质控制的限度测试杂质控制的限度测试• 药物物质或药物产品样品中活性成分或药物产品中其它成分的定量测试药物物质或药物产品样品中活性成分或药物产品中其它成分的定量测试USP：• 类别I — 类似于ICH 4• 类别II — 类似于ICH 2，3• 类别III — 用于性能参数测试的方法（如，溶出度，药品释放度） • 类别IV — 类似于ICH 1验证参数验证参数ICH：：•Accuracy Accuracy 准确性准确性•PrecisionPrecision（（repeatabilityrepeatability，，intermediate precisionintermediate precision）） 精密度（重复性，中间精密度）精密度（重复性，中间精密度）•Specificity Specificity 专属性专属性•Detection Limit Detection Limit 检测限检测限•Quantitation Limit Quantitation Limit 定量限定量限•Linearity Linearity 线性线性•Range Range 范围范围USP：•Accuracy 准确性•Precision 精密度•Specificity 专属性•Detection Limit 检测限•Quantitation Limit 定量限•Linearity 线性•Range 范围准确性准确性ICH：：“分析方法的准确性表示测定所得的结果与认可的常规真实值或标准值的接近程分析方法的准确性表示测定所得的结果与认可的常规真实值或标准值的接近程度。

有时也称为真实度有时也称为真实度USP：“分析方法的准确性表示该方法测定所得的结果与真实值的接近程度在方法的范围内建立分析方法的准确度精密度（精密度（1））ICH：：“分析方法的分析方法的精密度是指在规定的测试条件下，同一均匀供试品，经多次取样测精密度是指在规定的测试条件下，同一均匀供试品，经多次取样测定所得结果之间的接近程度（离散程度）精密度可以从以下三个方面考察：重定所得结果之间的接近程度（离散程度）精密度可以从以下三个方面考察：重复性，中间精密度，重现性复性，中间精密度，重现性USP：“分析方法的精密度指用同一种方法测试从同一个均匀供试品中取出的多个样品，其结果之间的一致程度”该定义也讨论了中间精密度和重现性精密度（精密度（2）重现性）重现性ICH：：•“重复性指在同样的操作条件下，在较短时间间隔内，测定所得结果的精密度，重复性指在同样的操作条件下，在较短时间间隔内，测定所得结果的精密度，重复性也可以称之为分析内精密度重复性也可以称之为分析内精密度”•“中间精密度指实验室内部的偏差：不同的时间，不同的分析人员，不同的仪器，中间精密度指实验室内部的偏差：不同的时间，不同的分析人员，不同的仪器，等等等等”•“重现重现性指不同实验室之间测定结果的精密度（合作研究，通常适用于方法的标性指不同实验室之间测定结果的精密度（合作研究，通常适用于方法的标准化）准化）”USP：“重复性指在同一个实验室，由同一个分析人员在较短时间间隔内使用同一个分析方法。

中间精密度指实验室内部的偏差，在不同的时间，不同的分析人员，使用同一实验室的不同的仪器”“在这里，重现性指在不同实验室使用同一个分析方法，如合作研究”精密度（精密度（3））ICH：：“一种分析方法的精密度通常用一系列测试的方差，标准偏差或者方差系数来表一种分析方法的精密度通常用一系列测试的方差，标准偏差或者方差系数来表示USP：“一种分析方法的精密度通常用一系列测试的标准偏差或者相对标准偏差（方差系数）”专属性的定义（专属性的定义（1））ICH：：“专属性系指在其他成分（如杂质、降解物、辅料等）可能存在下，采用的分析专属性系指在其他成分（如杂质、降解物、辅料等）可能存在下，采用的分析方法能够正确鉴定被分析物质的特性如采用的方法不够专属，应采用多个方法方法能够正确鉴定被分析物质的特性如采用的方法不够专属，应采用多个方法予以补充予以补充USP：<1225>参考了ICH的定义并增加了“【注—一些著名的国际机构倾向于使用“选择性”一词，保留专属性这个词以用于那些具有完全选择性的方法】”专属性的定义（专属性的定义（2））ICH：：鉴别测试：确证被分析物符合其特征鉴别测试：确证被分析物符合其特征杂质检查：确保可检出被分析物中杂质的含量，如有关物质、重金属、有机溶剂杂质检查：确保可检出被分析物中杂质的含量，如有关物质、重金属、有机溶剂等。

等含量测定（含量或效价）：得到供试品中被分析物的含量或效价的准确结果含量测定（含量或效价）：得到供试品中被分析物的含量或效价的准确结果USP：鉴别测试：确证被分析物符合其特征鉴别测试：确证被分析物符合其特征杂质检查：确保可检出被分析物中杂质的含量，如有关物质、重金属、有机溶剂杂质检查：确保可检出被分析物中杂质的含量，如有关物质、重金属、有机溶剂等含量测定（含量或效价）：得到供试品中被分析物的含量或效价的准确结果含量测定（含量或效价）：得到供试品中被分析物的含量或效价的准确结果检测限的定义检测限的定义ICH：：“检测限指试样中的被分析物能够被检测到的最低量，但不一定要准确定量检测限指试样中的被分析物能够被检测到的最低量，但不一定要准确定量”USP：“检测限是限度测试的一个特征指试样中的被分析物在规定的实验条件下能够被检测到的最低量，但不一定要准确定量因此，限度测试仅仅说明被分析物的含量高于或者低于某特定水平检测限通常用样品中被分析物的浓度（如百分比，ppb）来表示定量限的定义定量限的定义ICH：：“定量限指试样中的被分析物能够被定量测定的最低量，其测定结果应具有一定定量限指试样中的被分析物能够被定量测定的最低量，其测定结果应具有一定的准确度和精密度。

定量限是指对样品中低水平浓度的物质定量的一个参数，尤的准确度和精密度定量限是指对样品中低水平浓度的物质定量的一个参数，尤其是针对杂质或降解产物其是针对杂质或降解产物USP：“定量限是针对复杂样品中低水平浓度物质的定量检测的一个特征例如原料药中杂质或制剂中的降解产物定量限系指在规定的实验条件下，试样中的被分析物能够被定量测定的最低量，其测定结果具有一定的准确度和精密度定量限可用样品中被分析物的浓度（如百分比，ppb）来表示线性的定义线性的定义ICH：：“一个分析方法的线性是指该方法（在给定范围内）能够直接获得同样品中测试一个分析方法的线性是指该方法（在给定范围内）能够直接获得同样品中测试物浓度成比例的测试结果的能力物浓度成比例的测试结果的能力”USP：“线性系指在设定范围内，检测结果与供试品种被分析物的浓度（量）直接或者经由明确的教学转换呈线性关系的程度”范围的定义范围的定义ICH：：“范围系指能够达到一定的准确度，精密度和线性，测试方法是用的试样中被分范围系指能够达到一定的准确度，精密度和线性，测试方法是用的试样中被分析物高低限度浓度或量（包括这两个浓度）的区间析物高低限度浓度或量（包括这两个浓度）的区间。

USP：“范围系指能够达到一定的准确度，精密度，和线性，给定测试方法适用的试样中被分析物高低限度浓度或量”（包括这两个浓度）的区间范围通常采用与测试结果一致的单位（如百分比，PPM）其余的差别其余的差别ICH：：•包括一个术语表包括一个术语表•在单独的第二部分，给出了有关怎样考虑每个分析方法不同验证参数的建议在单独的第二部分，给出了有关怎样考虑每个分析方法不同验证参数的建议USP：•增加了ICH再验证的要求“提交给USP一个修改的分析方法：或者将通用方法适用在一种新产品或原料上（参照下面的验证所需要的数据基础）•有关怎样考虑每个分析方法不同验证参数的建议贯穿于整个文件指导原则的差别指导原则的差别各指导原则的差异：各指导原则的差异：1、、 鉴别：鉴别：中检所（生物药）指导原则：专属性，耐用性通常需要验证；中检所（生物药）指导原则：专属性，耐用性通常需要验证；FDAFDA指导原则：耐用性通常不需要验证，只需要验证专属性；指导原则：耐用性通常不需要验证，只需要验证专属性；中检所（化药）指导原则，中检所（化药）指导原则，ICH指导原则：专属性需要验证，耐用性的验证无明指导原则：专属性需要验证，耐用性的验证无明确指示。

确指示2、、 杂质检查（定量实验）：杂质检查（定量实验）：FDA和和ICH指导原则：检测限度在有些情况下是需要验证的；指导原则：检测限度在有些情况下是需要验证的；中检所（生物药）指导原则：检测限度通常是不需要验证的；中检所（生物药）指导原则：检测限度通常是不需要验证的；中检所（化药）指导原则：无明确指示中检所（化药）指导原则：无明确指示3 3、杂质检查（限度实验）：、杂质检查（限度实验）：FDA指导原则：耐用性在有些情况下是需要验证的；指导原则：耐用性在有些情况下是需要验证的；中检所（生物药）指导原则：耐用性通常是需要验证的；中检所（生物药）指导原则：耐用性通常是需要验证的；中检所（化药）指导原则，中检所（化药）指导原则，ICH指导原则指出对于耐用性的验证并没有明确指示指导原则指出对于耐用性的验证并没有明确指示4 4、含量测定：、含量测定：各指导原则基本统一，除了检测限度和定量限度外，其他各验证项目均需要验证各指导原则基本统一，除了检测限度和定量限度外，其他各验证项目均需要验证鉴别鉴别鉴别鉴别测试的方法验证测试的方法验证测试的方法验证测试的方法验证PART III鉴别实验评估的要求鉴别实验评估的要求Specificity 专属性ICHSpecificity 专属性USP专属性专属性 [1] –“适当的鉴别测试应该能够区分可能共存的结构相似的化合物。

需确证被分析的供试品呈正反应（可与已知的对照品比较），而不含被测成分的样品呈负反应此外，结构相似或组分中的有关化合物也应呈负反应选择这些潜在的干扰物质应该基于合理的科学判断，考虑有哪些干扰可能出现[Q2(R1)]专属性专属性 [2] –有些分析方法不具备足够的专属性 - 滴定法含量测定 - 对映体含量的非手性方法测试 - 通过紫外吸收进行的鉴别测试–推荐结合使用两种或更多的分析方法以达到充分的专属性专属性专属性 [3] –对于阐述稳定性指示的方法来说，专属性有其重要稳定性指示分析稳定性指示分析–“是能检测出原料药或制剂的性质随着时间的延长而出现变化的验证过的定量分析方法它可以精确检出有效成分，而不受降解产物、工艺杂质、辅料或其他可能杂质的干扰 FDA工业指导原则-分析步骤和方法验证，2000鉴别实验鉴别实验 [1]–正反应结果-比较已知的对照品与包含被分析成分的样品 - 已建立的测试方法 - 特征明显的标准品–负反应结果-不含被测组分的样品鉴别实验鉴别实验 [2]–对于结构相似或组分中的有关化合物呈负反应–选择这些潜在的干扰物质应该基于合理的科学判断，考虑有哪些干扰可能出现。

鉴别实验鉴别实验 [3]USP各论中常采用多个方法进行鉴别测试各论中常采用多个方法进行鉴别测试 例如：双氯芬酸钠例如：双氯芬酸钠–A: 红外吸收<197>–B: 色谱纯度测试中，双氯芬酸峰在测试溶液图谱中的保留时间与分离度溶液图谱中的一致–C: 灼烧残渣的焰色反应与钠一致<191>红外吸收光谱（摘自红外吸收光谱（摘自<197>））–“待测样品红外谱图的最大吸收峰与经相似处理过的USP标准品的最大吸收峰波数一致待测样品干燥条件需与相应的标准品规定的干燥条件一致，除非标准品另有规定或不需干燥保留时间保留时间需要注意以下重要的两点（摘自<621>）–“色谱保留时间是化合物表现的性质但不是特有的待测品和标准品的保留时间一致可用作结构鉴定的一个特征，但仅靠此一点不足以确认–同一个给定化合物的绝对保留时间在不同的谱图里可能是不一样的钠（摘自钠（摘自<191>））–“含钠的化合物在无色的火焰中显示亮黄色”如果一切顺利如果一切顺利–若待测样品中包含适当的相似的化合物，且所有的测试结果一致（根据实际情况呈正反应或者负反应），则该鉴别测试方法的验证完成注：相似化合物的选择要基于良好合理的科学判断。

–不管用何种方法，要确保在验证方法里描述清楚有哪些相似化合物需要参与验证你不需要验证所有可能的污染物若生产/合成路线发生本质变化，鉴别测试部分则需要重新验证假如进展不顺利假如进展不顺利–尝试使用不同的条件，检验这种方法是否有效如果找不到使之有效的条件，就要尝试其他的方法–对于微生物方法经常性的事情就是改变所需微生物的生长条件，使其能适合法定方法的应用结束语结束语–谨记，鉴别测试的最终目的是确保识别出被测组分无论最终采用了一系列怎样的方法，必须能够在其他组分可能存在的情况下，识别出样品中被测组分杂质检查方法的验证杂质检查方法的验证杂质检查方法的验证杂质检查方法的验证杂质定量检查方法杂质定量检查方法ICH：：§Specificity 专属性§Accuracy 准确度§Precision(all three aspects) 精密度（三个方面）§Detection limit 检测限§Quantitation limit 定量限§Linearity 线性§Range 范围 §Robustness 耐用性验证内容验证内容USP：：§Specificity 专属性§Accuracy 准确度§Precision(all three aspects) 精密度（三个方面）§Detection limit 检测限§Quantitation limit 定量限§Linearity 线性§Range 范围§Robustness 耐用性注：注：ICH、FDA，检测限在有些情况下是需要验证的，检测限在有些情况下是需要验证的 ；；SFDA指导原则，检测限通常是不需要验证的指导原则，检测限通常是不需要验证的 杂质限度检查方法杂质限度检查方法ICH：：§Specificity 专属性§Detection limit 检测限§Robustness 耐用性验证内容验证内容USP：：§Specificity 专属性§Detection limit 检测限§Accuracy(may be required) 准确度(可能要求)§Range(may be required) 范围(可能要求)§Robustness 耐用性FDA指导原则：耐用性在有些情况下是需要验证的；指导原则：耐用性在有些情况下是需要验证的；SFDA指导原则：耐用性通常是需要验证的指导原则：耐用性通常是需要验证的 专属性专属性 [1] 专属性专属性：： 指有其他成分（杂质、降解物、辅料等）可能存在情况下采用的方法能准确测定出被测物的特性。

能反映该方法在有共存物时对供试物准确而专属的测定能力，是指该法用于复杂样品分析时受到干扰程度的度量专属性专属性 [2] 杂质检查杂质检查专属性含义：专属性含义： ICH Q2A “纯度检查：确保采用的分析方法可检出被分析物中杂质的准确含量，如有关物质、重金属、溶剂残留量等” USP<1225> “纯度检查：确保实施的所有分析方法能够准确检出被分析物的杂质含量（如有关物质检查、重金属限度、有机挥发性杂质）” SFDA《《化学药物质量控制分析方法验证化学药物质量控制分析方法验证技术指导原则技术指导原则》》 “作为纯度检查，所采用的分析方法应确保可检出被分析物中杂质的含量，如有关物质、重金属、有机溶剂等”专属性专属性 [3] –色谱法和其他方法：附代表性图谱说明专属性，并应恰当地标明诸成分–在色谱方法中，应在一等程度上考察关键性的分离关键性的分离-可通过两个洗脱程度最接近的化合物的分离度来证明专属性专属性 [4] –非专属性的含量测定方法可采用其他分析方法予以支持 例：rh-GH HPLC分子排阻法测定rh-GH含量，HPLC反相法测定相关物质 专属性专属性 [5] 有两种基本途径用来确定杂质检查方法的专属性有两种基本途径用来确定杂质检查方法的专属性•有杂质或降解产物标准品•没有杂质或降解产物标准品专属性专属性 [6] –杂质获得 - 可从历史数据获得降解物和杂质的信息 - 建立杂质和降解产物库并对其定性 - 可以获得足够的量 专属性专属性 [7] –当杂质可以获得时 - 杂质检查•向原料药或制剂中加入适量的杂质•证明杂质之间以及杂质和样品中其它物质能够得到分离 专属性专属性 [8] –当杂质不能获得时 破坏性试验破坏性试验 高温、高湿、光照、酸破坏、碱破坏、氧化破坏 注意观察降解产物生成情况，分离度是否符合要求。

注意掌握破坏条件，应使主成分产生10-30%降解10%左右个案研究：破坏试验条件溶液置于0.05M盐酸（8小时）溶液置于0.02M氢氧化钠（8小时）溶液置于0.15%H2O2 （1.5小时）将样品溶液加热至100度（9小时）紫外光照射（14天） 专属性专属性 [9] –破坏实验 应将破坏前后检出的杂质情况进 行比较，比较前后检出的杂质个数和量；证明杂质之间以及杂质和样品中其它物质能够得到分离 峰纯度检测是很有用的，它显示被测物色谱峰是单个还是多个成分(如二极管阵列、质谱) 杂质检查的准确性杂质检查的准确性 [1] 准确性：对于杂质定量检查（非限度检查），有必要确定方法的准确性定义–USP – “用该方法测定的结果与真实值的接近的程度”– ICH – “用该方法测定的结果与被认可的常规真实值或参考值之间接近的程度”–SFDA (化药) – “准确度系指用该方法测定的结果与真实值或认可的参考值之间接近的程度有时也称真实度–SFDA(生物药) – 分析方法的准确性是指测定值与真实值或认可的参考值的一致性或接近程度杂质检查的准确性杂质检查的准确性 [2] –准确性 - 当杂质可获得时•在试样中加入杂质 - 当杂质不能获得时•与参考方法比较•采用药品的回收率 杂质检查的准确性杂质检查的准确性 [3] 参见<1225>–A.“准确性可通过加入已知量的被测物的回收率（%）计算得到–B. 准确性可通过计算平均值和被认可的真实值的偏差得到，结果应含置信区间。

杂质检查的准确性杂质检查的准确性 [4] 回收试验：测定值（回收试验：测定值（M M）、空白、已知量）、空白、已知量A A的对照品测定的对照品测定回收率：回收率： 加样回收试验：测定值（加样回收试验：测定值（M M）、背景值（）、背景值（P P）） 、、 已知已知量的加入的对照品（或标准品）的值（量的加入的对照品（或标准品）的值（A A）） 59回收率：回收率： 杂质检查的准确性杂质检查的准确性 [5]回收实验回收实验杂质检查的准确性杂质检查的准确性 [6]加样回收实验加样回收实验杂质检查的准确性杂质检查的准确性 [7] –“ICH推荐，准确度的评价应涵盖所规定的范围，至少用3个不同浓度，并至少测定9次（例如，3个不同浓度样品，各测定3次）”–杂质检查准确性参考接受标准：各浓度下的平均回收率均应在80.0%-120.0%之间，RSD应不大于10% 精密度精密度[1]精密度–杂质定量测定要做精密度考察–精密度是指在规定条件下，同一个均匀样品，经多次取样测定所得结果之间的接近程度用偏差（d）、标准偏差(SD)、相对标准偏差(RSD)（变异系数CV）表示偏差偏差(d):(d): 标准偏差标准偏差SD: 相对标准偏差相对标准偏差RSD: 64 精密度精密度[2]精密度精密度[3]–精密度应在方法规定的定量范围内求得–精密度可以从三个层次考察：重复性、中间精密度、重现性。

–方法的精密度应包括从样品准备到最终测试结果中所有的变异来源重复性重复性重复性 –重复性系指在同样的操作条件下，在较短时间间隔内，由同一分析人员测定所得结果的精密度 –重复性测定可在规定范围内，•用9次测定结果进行评价，制备3个不同浓度的试样，各测定3次，即3×3水平•或100％的浓度水平，用至少测定6次的结果进行评价–杂质检查重复性接受标准：RSD＜15％ 中间精密度中间精密度中间精密度：同一实验室，不同时间由不同分析人员用中间精密度：同一实验室，不同时间由不同分析人员用不同设备所得结果的精密度（三人三机）不同设备所得结果的精密度（三人三机）样品浓度样品浓度分析员分析员1，，HPLC系统系统1，，day1分析员分析员2，，HPLC系统系统2，，day2分析员分析员3，，HPLC系统系统3，，day3RSD三种不同浓度（涵盖范围）datadatadata每个浓度下测得数据的RSD接受标准：RSD＜20％中间精密度中间精密度–中间精密度试验变动因素 - 分析人员 - 日期 - 设备 - （色谱柱） 中间精密度中间精密度 由变动因素影响的测试结果的重现性 HPLC重现性重现性重现性–指不同实验室之间不同分析人员测定结果的精密度–当分析方法将被法定标准采用时，应进行重现性试验。

精密度和准确度精密度和准确度 精密度和准确度精密度和准确度–准确度一般以回收率（%）表示–精密度一般以RSD表示检测限检测限-杂质杂质[1] 检测限：检测限： 有些杂质检查方法用于限度检查这些方法的验证需要测定检测限 <1225>：“检测限是指在实验条件下，被分析物能够被检测到的最低量，但不必准确定量检测限检测限-杂质杂质[2]<1225>：“对于非仪器分析方法，检测限一般通过对一系列有已知浓度被测物的试样进行分析，确定能被可靠检测出的最低浓度或量” “对于仪器分析法，也可采用非仪器分析方法中所描述的相似方法但要注意这仅适用于没有背景噪音的仪器”检测限检测限 [3]在Q2(R1)中描述了两种测定仪器检测限的方法–根据信噪比–根据响应值的标准差和斜率 - 根据空白的标准偏差 - 根据标准曲线 检测限检测限 [4]–信噪比法：一般以信噪比为3：1时相应的浓度或注入仪器的量确定检测限检测限检测限 [5]–根据响应值的标准差和斜率 检测限（DL）可表示为: DL=3.3δ /S 其中，δ =标准偏差，S=斜率检测限检测限[6] 定量限定量限 [1]定量限：定量限：某些杂质检查方法用于定量。

这些方法的验证需要进行定量限的测定<1225>“定量限是指在规定的实验条件下，试样中被测物能被定量测定的最低量，并且结果应具有可接受的精密度和准确度定量限定量限 [2]在Q2(R1)中描述了两种测定仪器定量限的方法–根据信噪比–根据响应值的标准差和斜率定量限定量限 [3]信噪比法：一般以信噪比为10：1时相应的浓度或注入仪器的量确定定量限待测物待测物名称名称浓度浓度保留保留时间时间峰面峰面积积平均峰平均峰面积面积信噪比信噪比（（S/N））检测限（检测限（S/N=10±1，，ppm））杂质LOQ溶液RSD————————可接受标准：保留时间的相对标准差应不大于可接受标准：保留时间的相对标准差应不大于2.0%2.0%，，峰面积的相对标准差应不大于峰面积的相对标准差应不大于5.0%5.0%定量限定量限 [4]–根据响应值的标准差和斜率 定量限（QL）可表示为 QL=10δ /S 其中，δ =标准偏差，S=斜率定量限定量限[5]杂质杂质-线性线性线性：线性：–“分析方法的线性是指在给定的范围内，直接得到的或经明确的数学转化得到的测试结果与被分析物的浓度成比例关系的能力。

杂质杂质-线性线性–线性是定量测定的基础，杂质定量试验需要验证线性–线性应在分析需要的范围内进行评价–通过适宜的统计学方法•线性回归（y = mx + b）•相关系数，y轴截距（b），斜率（m）杂质杂质-线性线性–验收准则应权衡科学的严谨性和实际的需要–线性- - r2最小值- ≥0.99到≥0.9999 - Y轴截距- 在标准溶液响应值的n%内，在统计学上 不显著 杂质杂质-线性线性–相关性- r2 ≥ 0.990–Y轴截距- 小于标准响应值的±20%，在统计学上不显著范围范围[1]Ø范围是指达到一定精密度、准确度和线性的条件下，测试方法适用的高、低限浓度或量的区间Ø范围是规定值，在试验研究开始前应确定验证的范围 范围范围[2]–杂质测定范围： SFDA:应为被测杂质规定限度的±20% ICH: 应为杂质报告水平至标准规定的120% - 对已知有异常功效、能产生毒性或不可预见的药理作用的杂质，检测/定量限应与杂质需控制的水平相当–如果用一个试验同时进行含量和纯度检查，且仅用100%的标准品，线性范围应覆盖报告水品至标准规定的120%范围范围[3]90耐用性耐用性•耐用性系指测定条件发生小的变动时，测定结果不受影响的承受程度。

•耐用性主要考察方法本身对于可变试验因素的抗干扰能力开始研究分析方法时，就应考虑其耐用性如果测试条件要求苛刻，则建议在方法中予以写明 耐用性耐用性液相色谱的典型变动： • 流动相pH（±0.5) • 流动相组成(有机相±5%） • 色谱柱（同一厂家的三个批号，或两个不同厂家（同固 定相和填充物，尺寸） • 温度和流速(±10%） • 检测波长(±5nm)气相色谱的典型变动： • 色谱柱（同一厂家的三个批号，或两个不同厂家（同固定相 和填充物，尺寸） • 温度 • 流速耐用性耐用性•如果测试条件要求苛刻 ，则建议在方法中予以写明含量测定方法验证含量测定方法验证含量测定方法验证含量测定方法验证PART VUSP Professional Education 含量含量 概要：–含量测定的定义–含量测定方法验证所涉及的性能参数•参数定义•参数实验设计•接受标准•实例分析USP Professional Education 含量定义含量定义 •USP众多方法中，含量属于第一类。

更详细的信息见<1225>： “含量是针对原料药主成分或者成品制剂中活性成分（包括防腐剂）的定量分析 含量测定目的:是得到供试品中被分析物的含量或效价的准确结果USP Professional Education 含量测试方法含量测试方法ICH：：§ 准确度§ 精密度（重复性、 中间精密度、重现性）§ 专属性§ 线性§ 范围 验证内容验证内容性能参数性能参数USP：：§ 准确度§ 精密度（重复性、 中间精密度、重现性）§ 专属性§ 线性§ 范围 USP Professional Education 专属性专属性摘自ICH Q2(R1)–专属性是一种在其他成分（如杂质，降解物，辅料等）可能存在下，采用的分析方法能够正确鉴定，检出被分析物的特性–验证目的•能准确地反映样品中待测物的含量或效力的精确结果USP Professional Education 专属性专属性•在杂质可获得的情况下–对于主成分含量测定可在供试品中加入杂质或辅料，并与未加杂质和辅料的供试品比较测定结果，考察测定结果是否受干扰。

•在杂质或降解产物不能获得的情况下–可采用另一个经验证了的或药典方法进行比较，对比两种方法测定的结果–也可采用破坏性试验（强光照射，高温，高湿，酸、碱水解及氧化），得到含有杂质或降解产物的试样，用两种方法进行含量测定，比较测定结果–必要时进行色谱峰纯度检查，证明含量测定成分的色谱峰中不包含其他成分 USP Professional Education Case Study [1]•以HPLC含量测定法为例对以下色谱图的比较：–稀释液–药品X标准溶液–强制降解条件下的样品溶液–主峰峰纯度测试和光谱分析USP Professional Education Case Study [2]稀释液色谱图稀释液色谱图接受标准：在主要物质和杂质的保留时间处，稀释液不得有可检测出的峰USP Professional Education Case Study [3]标准溶液色谱图标准溶液色谱图接受标准：已知杂质须能相互并与主峰分离（分离度不低于1.5）USP Professional Education Case Study [4]•强制破坏实验–溶于0.05M盐酸中（8小时）–溶于0.02M氢氧化钠中（8小时）–溶于0.15%双氧水中（1.5小时）–加热样品溶液至100°C（9小时）–加热固体样品至120°C（17小时）–紫外光下（14天）USP Professional Education Case Study [5]接受标准：降解产物须与主峰分离（分离度不低于1.5）强制降解条件下的样品溶液强制降解条件下的样品溶液USP Professional Education 专属性专属性•主峰峰纯度测试目的：–主峰上有明显的降解产物峰，测定方法不可行。

–如未对峰纯度进行有效分析，则无法判定主峰中是否包含着降解产物峰–对于制剂，如未对峰纯度进行有效分析，则无法判定辅料降解是否对测定结果有干扰USP Professional Education 专属性专属性•主峰峰纯度检测方法（杂质结构确认）:–红外光谱–核磁共振谱–质谱–色谱USP Professional Education Case Study [6]接受标准：在强降解实验中，主峰峰纯度测试（相似度不低于980）主峰峰纯度测试主峰峰纯度测试结果结果USP Professional Education 线性线性•线性是指响应（测试结果）与试样中被测物质浓度直接呈正比关系的程度•线性是定量测定的基础，涉及定量测定的项目，如杂质定量试验和含量测定均需要验证线性 •应在设计的测定范围内测定线性关系USP Professional Education 线性线性•可用一贮备液经精密稀释，或分别精密称样，制备一系列被测物质浓度进行测定，至少制备5个浓度。

以测得的响应信号作为被测物浓度的函数作图，观察是否呈线性，进行线性回归 •R2应≥0.99到0.9999•Y轴截距:在标准溶液相应值的n%内，在统计学上不显著•必要时，响应信号可经数学转换，再进行线性回归计算，并说明依据 USP Professional Education 线性线性•以HPLC方法为例：–在测量浓度范围内配制6份浓度不同的供试液，各浓度分别测定3次，每次做3个平行，分别测定其主峰的面积，计算相应的含量–以含量为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y），进行线性回归分析    –可接受的标准为：回归线的相关系数（R2）不得小于0.99，Y轴截距应在100％标准浓度响应值的2％以内USP Professional Education 范围范围•范围系指能达到一定的精密度，准确度和线性，测试方法适用的高低限浓度或量的区间•范围是规定值，具体的范围一般根据检测的目的而设定，并通常从线性研究中得到–定量测定的检测项目均需要对范围进行验证•范围通常用与分析方法的测试结果相同的单位（如百分浓度）表达。

USP Professional Education 范围范围•验证时所设定的范围应至少包括了检定标准中规定的范围，如标准中规定成品浓度应为标示量的80％～120％，则验证的范围可设定为标示量的70～130％•确定范围的方法为：供试品浓度（含量）在范围末端（最高和最低限）和范围内时，均能获得满意的线性、精密度和准确性USP Professional Education 准确度准确度 •USP- "该法测定所得的结果与真实值的接近程度•ICH- “该法测定所得的结果与认可的常规真实值或标准值的接近程度USP Professional Education 准确度准确度•一定的准确度为定量测定的必要条件，因此涉及到定量测定的检测项目均需要验证准确度，如含量测定、杂质定量试验等•方法：–准确度应在规定的范围内建立，对于制剂一般以回收率试验来进行验证–也可在精密度，线性和专属性被确认后，推断得出。

–与已知准确性的方法进行比较（标准方法）USP Professional Education 准确度准确度•试验设计需考虑在规定范围内，制备3个不同浓度的试样，各测定3次，即测定9次，报告已知加入量的回收率（％） •具体的验证方法案例为：–验证时一般要求分别配制浓度为80％、100％和120％的供试品溶液各三份，分别测定其含量，将实测值与理论值比较，计算回收率    –可接受的标准为：各浓度下的平均回收率均应在98.0%-102.0%之间，9个回收率数据的相对标准差（RSD）应不大于2.0%USP Professional Education 精密度精密度USP：“重复性指在同一个实验室，由同一个分析人员在较短时间间隔内使用同一个分析方法中间精密度指实验室内部的偏差，在不同的时间，不同的分析人员，使用同一实验室的不同的仪器在这里，重现性指在不同实验室使用同一个分析方法，如合作研究USP Professional Education 精密度精密度 •同一均质供试品，经多次取样进行含量测定的结果之间的接近程度。

•精密度应在方法规定的定量范围内求得•精密度以相对标准方差（RSD）表示USP Professional Education 精密度（重复性）精密度（重复性）ICH：•目的：确定在同一个试验内同一个供试品在测量范围内的不同浓度时测定的精密度•方法1：–配制3个稀释度的供试品（测量范围内的高、中、低浓度）–每一个稀释度重复测定至少3次–计算每一浓度测定结果的均值和SD–计算每一浓度的RSD值•方法2：–配制至少6份相同浓度的供试品溶液（100%浓度水平），–计算至少6份样品浓度测定结果的均值、SD和RSD值•接受标准：所得含量的相对标准差（RSD)应不大于2.0%USP Professional Education 精密度（中间精密度）精密度（中间精密度）•目的：确定在不同试验间对测量范围内同一个供试品在不同浓度时测定的精密性•方法：–配制3个稀释度的供试品（测量范围内的高、中、低浓度）–在3个试验中对每一个稀释度重复测定3次–分析人员–设备–日期–不同批号或来源的实验材料–计算每一试验中每一浓度测定结果的均值和SD–计算试验间每一浓度的RSD值接受标准：所得含量的相对标准差（RSD)应不大于2.0%。

USP Professional Education 精密度（重现性）精密度（重现性）•当分析方法将被法定标准采用时，应进行重现性试验–FDA–公司内至少两个实验室-参照FDA：色谱分析方法验证指南.1994.–FDA–对于多实验室，按照“用于测定分析方法精确性的实验室间协作研究的标准规程”–AOAC（美国官方分析化学师协会）–8个样品，8个实验室–Statistical Manual of the AOAC W.J. Youden and E.H. SteinerUSP Professional Education 耐用性耐用性•耐用性–分析方法的耐用性是指试验参数被有意进行微小改变时，测量结果不受影响的能力，用于说明通常使用条件下该分析方法的可靠性USP Professional Education 耐用性耐用性•耐用性主要考察方法本身对于可变试验因素的抗干扰能力•经试验，应说明小的变动能否符合系统适用性试验要求，以确保方法有效•根据具体情况，可针对一个或几个关键的参数进行验证。

–开始研究分析方法时，就应考虑其耐用性如果测试条件要求苛刻，则建议在方法中予以写明USP Professional Education 耐用性耐用性耐用性关键系数的选择方法验证汇总方法验证汇总PART VI为什么进行验证？为什么进行验证？•验证是阐述性能参数符合分析应用目的的要求的过程•通过适当的实验数据和分析的文化记录来阐明验证方案起草验证方案起草起草一个适合的验证方案，应考虑：•分析方法的目的•性能参数的选择•基于以下方面考虑的适当的接受标准—使用目的（定量/定性）—先前的要求—来自研发部门针对QC/法定方法验证进行的预验证数据验证方案验证方案 验证方案包括：•分析方法描述和它的使用目的•涉及的性能参数列表•适当的接受标准•复核和批准人签名验证总结验证总结 选择验证参数和接受标准时应考虑用于分析的方法和产品类型：•必须报告所有结果•将数据和预设标准比较•适当的技术管理复核•源于法规要求的QA复核和批准GenSci。