拟南芥TDNA插入突变课件.ppt

拟南芥TDNA插入突变体的鉴定11、反向遗传学经典遗传学：由表及里，即通过杂交等手段观察表型性状的变化而推知遗传基因的存在与变化 表型基因反向遗传学：由里及表，即通过DNA重组等技术有目的地、精确定位地改造改造基因的精细结构以确定这些变化对表型性状的直接影响 基因表型2研究基因功能的方法1、转基因技术2、基因敲除3、基因敲入4、基因诱导超表达5、基因诱捕技术6、 RNAi干扰7、生物信息学分析8、反义技术 1、反向遗传学32、反向遗传学的重要手段T-DNA插入突变技术T-DNA插入突变技术，通过插入已知序列的T-DNA，破坏目标基因的结构使之沉默；将目的基因插入到Ti质粒的T-DNA上，通过农杆菌的转化作用，将目的基因整合到植物细胞染色体DNA上，使目的基因的遗传特性得以稳定维持和表达农杆菌是一种在土壤中生活的微生物，能在自然条件下感染双子叶植物和裸子植物，而对大多数单子叶植物没有感染能力根癌农杆菌和发根农杆菌中细胞中分别含有Ti(Tumourinducing)质粒和Ri质粒，其上有一段T-DNA(TransferringDNA)，它能稳定地整合到植物基因组中并稳定地表达Ti质粒已成为植物分子生物学中广泛应用的遗传转化载体，而外基因就是整合到T-DNA上的。

4农杆菌质粒2、反向遗传学的重要手段T-DNA插入突变技术Duringtumourinduction,AgrobacteriumattachesontoplantcellsandthentransferspartofitsDNAtosomeofthesecells.ThetransferredDNA(T-DNA)whichisfoundonalargeTi(tumourinducing)plasmid，ismodifiedwithinthebacteriumandistransferredtotheplantwhereitbecomesintegratedintotheplantgenome.5themechanismofT-DNAinsertionProteinswhichareencodedbythevirulence(vir)regionoftheTiplasmidregulatetheT-DNAmodificationandtransfer.Phenoliccompoundsthatarederivedfromawoundedplantcellinduceexpressionofthevirregiongenes.Virulenceproteinsrecognisethebordersequences(LB、RB)thatdefinetheT-DNA.InthepresenceofVirD1protein,VirD2cleavesthebordersequence.Asingle-strandedT-DNAisproducedwhenthenickedDNAisreleasedfromtheplasmid.2、反向遗传学的重要手段T-DNA插入突变技术themechanismofT-DNAinsertion2、反向遗传学的重要手段T-DNA插入突变技术6Intheplantcell,theT-DNAiscoatedwiththesingle-strandedDNA-bindingprotein,VirE2.ThecomplexthatcomprisesoftheT-DNAboundtothebindingproteinthenmovesintothenucleusandisintegratedintothenucleargenome.themechanismofT-DNAinsertion2、反向遗传学的重要手段T-DNA插入突变技术7转化过程示意图2、反向遗传学的重要手段T-DNA插入突变技术来源：arabidopsis.info/students/paaras/t_dna.htm83、反向遗传学方法研究赤霉素糖苷转移酶基因（1）研究背景（2）模式生物拟南芥（3）筛选纯合突变体（4）表型鉴定9（1）研究背景赤霉素可促进叶和芽的生长，用于农业生产，在某些方面有较好的效果。

赤霉素的生物合成和代谢对赤霉素活性的调控作用已了解的比较清楚植物界广泛存在的赤霉素糖基化修饰对赤霉素活性的作用，以及糖基化修饰能否调控以及如何调控赤霉素的活性并进而影响植物的生长发育的问题尚未解决10拟南芥是一种十字花科植物，广泛用于植物遗传学、发育生物学和分子生物学的研究，已成为一种典型的模式植物植物特点：(1)生长周期短,6周内完成;(2)基因组小,仅有5条染色体,113亿个碱基对,但是它的大多数基因与其他“复杂”的植物基因具有很高的同源性， (3)具有双子叶植物的所有特性(4)有效的农杆菌介导转化途径,易获得大量的突变体和基因组资源;(5)在有限的空间内可大量种植，体形小,占地少(6)收获大量的种子，每株拟南芥可产生多达5000粒种子；(7)生活力强，用普通培养基就可作人工培养2）模式生物拟南芥Arabidopsis thaliana11目前已经完成测序的植物有三种：拟南芥、水稻、毛果杨(Populustrichocarpa)美国NCBI下面的植物基因组数据库资料：http:/www.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/PLANTS/PlantList.html拟南芥的基因敲除文库的建立12实验方案设计1.确定所要研究的基因 通过生物信息学的方法推测出一些可能具有赤霉素糖基转移酶的基因。

2.获得种子进入如下网站http:/arabidopsis.org/index.jsp，输入种子基因型号3）筛选纯和突变体1、实验方案设计（3）筛选纯合突变体13点击进入基因序列信息网页实验方案设计（3）筛选纯和突变体实验方案设计（3）筛选纯合突变体14输入种子基因型号实验方案设计（3）筛选纯合突变体15点击进入基因序列网页实验方案设计（3）筛选纯合突变体16基因序列网页实验方案设计（3）筛选纯合突变体17查找突变体及引物设计实验方案设计（3）筛选纯合突变体18输入基因型号实验方案设计（3）筛选纯合突变体19查看含有相关基因的种子信息实验方案设计（3）筛选纯合突变体20引物设计实验方案设计（3）筛选纯合突变体21中间引物的设计实验方案设计（3）筛选纯合突变体22两侧引物的设计实验方案设计（3）筛选纯合突变体232、实验材料赤霉素糖基转移酶基因的T-DNA插入突变种子：SALK_064481.43.20.x LP（左引物）： GCTGGAGTCCACAACTTGAAG Len 21 TM 59.90 GC 52.38 RP（右引物）： AACTCCTCCTCAAAGGCTCAG Len 21 TM 60.00 GC 52.38 器材：离心机，离心管，PCR仪，点泳池，电泳现象仪（3）筛选纯合突变体24实验原理（3）筛选纯和突变体三引物法3、突变体鉴定原理（3）筛选纯和突变体25“三引物法”即采用三个引物（LP、RP、LB）进行PCR扩增。

野生型植株（WT）目的基因的两条染色体上均未发生T-DNA插入，所以其PCR产物仅有1种，片段大小为基因的长度（即从LP到RP的长度）纯合突变体植株（HM）目的基因的两条染色体上均发生T-DNA插入，而T-DNA本身的长度约为17kb，过长的模板会阻抑目的基因特异扩增产物的形成，所以也只能得到1种以LB与RP（或LP，根据T-DNA在基因上插入的方向选择）为引物进行扩增的产物，分子量约410+Nbp（即从LP或RP到T-DNA插入位点的片段，长度为300+Nbp，再加上从LB到T-DNA载体左边界的片段，长度为110bp）；杂合突变体植株（HZ）只在目的基因的一条染色体上发生了T-DNA插入，所以PCR扩增后可同时得到410+Nbp和片段大小为基因的长度bp两种产物电泳结果差异明显，能有效区分不同基因型的植株26双引物法与“三引物法” 本质相同实验原理（3）筛选纯和突变体首先以基因组DNA作为模板，用一对特异引物(LP和RP)扩增目的基因片段，野生型和突变杂合体均一条带，纯合突变体没有条带;然后再以基因组DNA为模板，由T-DNA片段的特异引物(LB)与LP或RP组成一对引物，扩增目的基因T-DNA插入片,野生型没有条带，杂合体和纯合体一条410+N。

不足之处是完成最终鉴定需进行两轮PCR扩增27284.3电泳并观察结果配制琼脂糖凝胶，将扩增后的样品加入凝胶孔电泳，电泳后观察结果295.结果分析 使用三引物法PCR检测，若电泳图上出现一大一小两条带，则为突变杂合体；出现一条小带，则为突变纯和体；出现一条大带，则为野生型3）筛选纯和突变体30（4）表型鉴定反向遗传学31用PCR筛选出突变纯合体后，便可以利用反向遗传学的思路对纯合突变体进行一系列的基因功能的研究基因敲除所产生的突变表型，是该基因缺失后的表型，因而直接表明了该基因的功能与表型的关系，人们由此可以直接快速的检测得到基因的功能然而，有很多基因敲除突变体没有很明显的表型作用 （4）表型鉴定32表型不明显的原因 由于重复基因的存在，一个基因成员的突变导致的功能丧失会被另一个重复基因所弥补有些突变个体只有在特定的环境下、特定生长时期、特定生理状态下才表现突变性状，这类基因若在非表达阶段被突变，则不会产生明显的表型突变一些基因控制生物的代谢过程，并没有表型的改变 在多个生长阶段发挥作用的基因，其突变可能导致早期胚致死效应，因而也无法鉴定瞬间表达的基因、低水平表达的基因，以及在少数细胞中表达的基因，都很难用基因敲除突变体鉴定。

（PatrickJ.Krysanetal，1999） （赵霞，周波等，2009）（4）表型鉴定33表型鉴定应对策略Knock-knock突变体环境胁迫基因捕获载体和激活标签载体4）表型鉴定34Knock-knock突变体（Patrick J. Krysan et al，1999 ）（4）表型鉴定35突变-表型OnecaneasilydeterminetheprecisegenotypeoflargenumbersofindividualplantsbyusingtheT-DNAinsertionasaPCRmarkerforthemutantlocus.Suchanalysis,however,doesnotprovethatthePCR-identified,T-DNAinducedmutationisresponsibleforthephenotyperatherthanacloselylinked,unrelatedmutation.（4）表型鉴定方法lisolateadditionalmutantallelesforthelocuslcomplementthemutationbyintroducingawild-typecopyofthegeneintomutantplants（PatrickJ.Krysanetal，1999）36表型鉴定的一般思路（4）表型鉴定374、T-DNA的研究方向与价值近年来，借助于农杆菌介导的遗传转化技术，T-DNA插入技术已被广泛应用于拟南芥等模式植物的突变体库构建中。

在植物功能基因组学研究中发挥着重要作用，广泛应用于大规模植物基因功能分析，是分离新基因、研究基因功能的有效工具 构建突变体库，是反向遗传学的突破性技术之一38局限性：利用T-DNA插入突变体研究新基因，要求创建饱和突变体库，需要进行大规模的转基因工作，因此实验材料需要具有完善的遗传转化体系（水稻、拟南芥等模式生物）T-DNA转移和整合机制尚不清楚，有时会出现多拷贝插入，且容易产生直接的串联、反向重复和边界缺失等4、T-DNA的研究方向与价值39Ourteam4041拟南芥幼苗的移植用镊子小心地将幼苗从培养基中取出，移入土，此过程中注意保护幼苗的根部用营养土和蛭石以1：1的比例混合拌匀配制，以保证营养及透气性。