实时荧光定量pcr检测犬乳腺肿瘤vegf基因表达标准品质粒和标准曲线的构建.pdf

邱昌伟，林德贵 ( 中国农业大学动物医学院，北京海淀l 0 0 0 9 4 ) 横要：为了准确地分析血管内皮生长因子( V a s c u l a re n d o t h e li a lg r o w t hf a c t o r V E G F ) 在犬乳腺 肿瘤形成过程中的作用，建立了乳腺肿瘤V E G F 基因实时荧光定量聚合酶链反应检测方法．本试验设计了针 对p , f l E G F ／两特异性引物，提取乳腺肿瘤b g 织R N A 并扩增出目的片度，将P C R 产物克隆至) J p G E M - TE a s y 载体，经 质粒P C R 扩增、酶切和测序鉴定证实重组质粒构建成功．利用实时荧光定量R T - P c R 技术对基I 因m R N A 的表 迭水平进行研究非常可靠，研究结果具有可比性和重复性．为下一步对不同犬乳腺肿瘤组织中V E G F 基因表 达的定量打下了基础． 关冀词：V E G F ；乳腺肿瘤；实时荧光定量P C R ；犬 乳腺是犬猫肿瘤常发的部位，乳腺肿瘤的发病率仅次子皮肤瘤据研究报道，犬猫乳腺肿瘤的发病 率是人类乳腺肿瘤发病率的三倍，且该病的发生都与环境因素和遗传因素有关。

因此用患原发性乳腺肿瘤 的犬猫来作为研究人类乳腺肿瘤的模型尤为有意义恶性肿瘤的转移是影响患者预后的主要因素，肿瘤细 胞的血行或淋巴转移包含了一系列复杂的过程，其中肿瘤组织的血管生成及淋巴管生成是必不可少的环 节大量实验证明，血管内皮生长因子( V E G F ) 在恶性肿瘤的血管生成及转移扩散中起着重要作用，且V E G F 参与了胚胎发育过程中淋巴管网的的形成有研究表明，V E G F 在结肠癌中表达增高，并与淋巴转移呈正相 关为此，我们探讨了V E G F 在乳腺癌发生发展中的作用，以便为乳腺癌的综合治疗提供实验数据 目前，实时荧光定量P C R ( r e a l - t i m eq u a n t i t a t i v eP C R ) 技术已经广泛用于检测基因的表达水平，实时荧光 定量P C R 技术可以非常可靠、高灵敏度的对r m R N A 的表达进行绝对定量，用质粒D N A 构建标准曲线，以标准 曲线对样品m R N A 的表达进行可靠性很高的检测 在以往的研究中，大多数都是用免疫组织化学的方法或原位杂交对不同的乳腺组织中V E G F 进行检测， 这种方法不能对m R N A 进行绝对定量，只是一种半定量方法。

本研究构建了实时荧光定量P C R 检测不同犬 乳腺肿瘤组织中V E G F 基因表达标准品质粒和标准曲线为进一步阐释血管内皮生长因子( V E G F ) 在肿瘤 发生的分子机理奠定了基础 1 材料与方法 I , I 材料 新鲜乳腺组织标本取自中国农业大学动物医院2 0 0 5 ．8 - - 一2 0 0 6 ．5 手术的患病母犬，平均年龄1 0 岁包括 正常乳腺组织2 例，乳腺良性肿瘤2 2 例及恶性肿瘤1 8 例( 以浸润性导管癌为主) ，恶性肿瘤中伴有淋巴结转移 者3 例( 1 6 ．7 ％) 所有的病例在手术前均未接受过放疗或化疗D H 5 感受态细胞由农业部兽医诊断中心实验 室保存 1 ．2 主要试剂和仪器 R N A g e n t s RT o t a lR N AI s o l a t i o nS y s t e m 提取试剂盒( P r o m e g a 公 ) 、P C R 所用试剂p r o m e g a 公司) 、 D E P C ( P r o m e g a 公司) 、S Y B R * G r e e nq P C RK i t ( F I N NZ Y M E S 公司) 、肿删R e v e r s eT r a n s c r i p t a s e ( P r o m e g a 公司) 、E c o R I ( T a K a R a 公司) 、质粒快速提取试剂盒( 博大泰克公司) 、p G E M ∞- TE a s y V e c t o rS y s t e m s ( P r o m e g a 公司) 、E ．Z ．N ．AG e lE x t r a c t i o nK i t ( P r o m e g a 公司) 、T G R A N D I E N TP C R 仪呷A D 公司) 、实时荧光定量 P C R 仪( O P T I C O N2 型，M JR e s e a r c h 公司) 。

． ’ 1 5 I 豢． 燃恭惹 嚣建 型啪垒乳篇 羞 武汉华中农业大学 2 0 0 6 ．1 0 1 ．3 方法 1 ．3 ．I 组织R N A 提取将在液氮中冻存的新鲜乳腺组织取出，组织匀浆后，按照K N A g e n t s RT o t a lR N A I s o l a t i o nS y s t e m 试剂盒操作说明提取组织的R N A ，并根据A 2 酏值计算R N A 的浓度，以A 2 ∞／．A 2 ∞的比值判断其 纯度提取的R N A 用D E P C 处理的灭菌三蒸水融解，．8 0 ℃保存备用 1 ．3 ．2 组织总R N A 的R T - P C R 1 ．3 ．2 ．1 引物设计：按照已经发表的犬V E G F 基因m R N A 序列( G e r d 3 a n k 登录号为X M 5 4 0 0 4 7 ) 分析并设计一 对特异性引物上游引物为5 - C A GG C GT A TG C A ⅨⅪ舭AG A - 3 ’，下游引物为5 ’- G A GG T GG c TT G T G c rG G TG T - 3 ’，扩增目的片断长度为3 9 9 b p ( 1 4 5 ．5 4 3 b p ) 。

1 ．3 ．2 ．2 反转录( 1 ∞合成c D N A ：R T 的反应体积为2 0 # L ，逆转录反应体积如下：样品R N A 2 此、 2 ．5 m m o l ／L d N T P 2 # L 、o l i g o ( d T ) 1 8 ( 1 6 p m o l ／L ) 2 t t L ，5 x 逆转录缓冲液4 皿、A M V 反转录酶I # L ( 5 u ) 、 R N a s m l f ‘L ( 4 0 u ) * b 充D E P C 处理过的水至体积2 0 f t L 上述成分混匀后至于P C R 仪器中，4 2 ℃4 5 m i n , 9 9 " C 5 m i n 灭活A M V 酶 1 ．3 ．2 ．3P C R 扩增：P C R 扩增体系为反转录产物2 # L 、1 0 x P C R 反应缓冲液舢L 、2 ．5 m m 0 1 ／L d N T P 2 # L 、 O ．5 u ／肛L T a q D N A 酶2 # L 、1 0 p m o l ／# L 上下游引物各I # L 、1 5 m m o l ／L M g C l 2 2 弘L ，补充D E P C 处理过的水至体积2 0 # L 。

反应条件为：9 4 ℃预变性5 r a i n ：9 4 " ( 2 变性3 0 s 、5 5 ℃退火4 5 s 、 7 2 ℃延伸4 0 s ，共3 6 个循环；7 2 ℃延伸7 m i n 1 ．3 ．3 重组标准品质粒制备 1 ．3 ．3 ．1P C R 产：物纯化：P C R 产物经1 ．5 ％琼脂糖电泳，胶回收按照E ．Z ．N ．A o G e lE x t r a c t i o n 磁t 的操作说明对P C R 扩增片段进行纯化、回收 1 ．3 ．3 ．2P C R 产物与载体连接、转化：按照p G E M TE a s yV e c t o rS y s t e m s 试剂盒的说明书将纯化产物与 p G E M @ ．T 载体在T 4 D N A 连接酶作用下进行连接反应，构建扩增产物的重组质粒连 接体系为5 皿，其反应体系为：p G E M c D - TE a s yV e c t o r ( 5 0 n g ) 1 此、P C 贼化产物1 此、T 4 D N 硝毫接酶0 ．5 此、2 连接酶b u f f e r 2 ．5 皿将连接体系置于4 " C 水浴中过夜。

取待连接产物5 皿加入试剂A 2 0 “L 与7 5 此无菌水，稀 释成t 0 0 肛L ，冰上备用将混合液加A ．8 0 ．1 0 0 p L 感受态细胞并混匀，冰浴2 0 m i n ，室温放置1 0 m i n 加入 4 0 0 9 L L B 培养基，3 7 " C 2 0 0 r p m 摇l O - ．4 0 m i n 涂于A m p 、X ．G a L 和I P T G 处理的L B 琼脂平板上，3 7 C 过夜培养， 挑取单个白色菌落，在A m p + ／L B 液体培养基@ 3 7 " C 摇9 ．1 6 h 1 ．3 ．3 ．3 ．重组质粒的提取和鉴定：按照质粒快速提取试剂盒的操作要求对．经．A m p + ／L B 液体培养基3 7 " C 、 2 0 0 r ／r a i n 摇振培养的大肠杆菌进行重组质粒D N A 提取，对提取的质粒聊蛆进行重组质粒P C R 、酶切和测序 鉴定 1 ．3 ．3 ．4 重组质粒定量标准曲线的建立：测定阳性重组质粒的O D 值，计算出拷贝数将标准品重组质粒进行 1 0 倍系列稀释，以系列稀释的质粒为模板在实时荧光定量P C R 仪上扩增。

反应为2 0 皿体系，反应组分为： M i x l o b t L 、上游和下游引物( 1 0 p m o l ／L ) l 此、重组质粒D N A 2 u L 、灭菌三蒸水7 止反应条件与常规P C R 条 件相同，在每个循环内加入读板步骤，总延伸结束后，加入溶解曲线的制备( 6 5 —9 5 C 范围内，每0 ．2 ℃读板一 次) 步骤反应结束后，计算机自动得到标准曲线 2 ．结果 2 ．1 组织R N A 提取和目的基因片段的扩增 组织提取的总R N A 紫外分光A 2 √A 2 8 0 为1 ．8 —2 ．0 之间，电泳结果表明R N A 分子保持完整经R T - P C R 扩增， 产物用1 ．5 ％琼脂糖凝胶电泳，获得大约4 0 0 b p 左右的目的条带序列测定表明，获得的目的条带同原始序列 的同源性为1 0 0 ％ 2 ．2 标准模板的鉴定 对重组质粒D N A 进行P C R 扩增产物用1 ．5 ％琼脂糖凝胶电泳，获得4 0 0 b p 左右片段( 图1 ) ，和组织m R N A 经R T - P C R 扩增片段大小一致对提取的重组质粒D I N A 进行E a o R I 酶切，酶切鉴定的结果如图2 所示。

对重组 1 5 2 全国兽医外科学第1 3 次学术研讨会小动物医学第1 次学术研讨会暨奶牛疾病第3 次学术讨论会论文集 ：_ _ _ _ ‘ 质粒D N A 的测序结果经P u b m e db l a s t 分析，插入D N A 片段的序列与原始序列片段的同源性达到1 0 0 ％，说明 所插入的外源基因为目的基因片段，即质粒连接、转化成功，标准质粒构建成功 M ．．M a r k e rD L 2 0 0 0 ；1 - 4 ．重组质粒的P C R 扩增片段 M ．M a r k e rD L 2 0 0 0 ；1 - - 4P C Rp r o d u c t s 图l 重组质粒的P C R 扩增 F i g ．1P C Rd e t e c t i o no f p l a s m i d M M a r k e r D L 2 0 0 0 ；1 - 3 ．重组质粒的点幻R I 酶切。