周辉 胚胎移植移植技术 (2).doc

胚胎移植与体外受精技术鸡西实验中学生物教研组 周辉 2010.04.08胚胎移植胚胎移植是将良种雌性动物配种后的早期胚胎取出，移植道同种的生理状态相同的其他雌性动物体内，使之继续发育成为新个体，所以也称作借腹怀胎胚胎移植有什么意义：⑴ 可以充分发挥优良母畜的繁殖潜力，提高繁殖效率；　　⑵ 可以加速品种改良，扩大良种畜群；⑶ 可以控制疾病，克服不育；⑷ 可以代替种畜引进；⑸ 可以保存遗传资源；⑹ 胚胎移植也是其他胚胎技术（胚胎分割、胚胎嵌性、别鉴定和核移植等）的基础一、同期发情和超数排卵（一）供体、受体的选择 畜牧学选择：胚胎移植的供体一般是需要加速繁殖的生产能力较高的优良品种，受体则是繁殖性能高的本地品种兽医学选择：主要任务是排除病畜，尤其是要把那些生殖器官患有疾病的个体清理出去 （二）供体母畜的超数排卵　　排卵率可以通过药物的方法进行控制应用外源性促性腺激素诱发卵巢多个卵泡发育， 并排出具有受精能力的卵子的方法， 称为超数排卵，简称“超排”大量研究证明，引起家畜超数排卵的物质是与生殖生理有关的激素或促激素，并且较深入了解了引起卵成熟和排卵的机理，使超数排卵技术广泛应用于家畜繁殖。

各种激素的作用：对卵巢产生作用并能引起卵的成熟和排卵的激素主要有：孕酮，雌二醇（E2），促卵泡激素（FSH）、促黄体激素（LH）、促性腺激素释放激素（GnRH）等这些激素对卵巢的作用有相同之处，但也有差别促黄体激素（LH）和孕酮的急剧增加是排卵的直接原因，排卵后剩下的卵泡细胞转变为黄体，并分泌孕酮，抑制其他卵泡的发育一般都采用促卵泡素（FSH）+前列腺素F2α(PGF2α)超排药物系列，也有人用孕马血清促性腺激素（PMSG）+PMSG搞血清+ PGF2α诱导家畜超数排卵，都需注射外源激素，其目的就是人工的使动物的激素水平达到阈值从而诱发卵的成熟与排放超数排卵的方法采用不同激素组合的方法进来研究较多，其中诱导母牛超数排卵的试验归纳起来有：1）促卵泡素（FSH）＋其他激素：小剂量多次注射FSH，每天两次，3～4天，第3～5天注射前列腺素（PGF2α）以溶解黄体；2）孕马血清促性腺素（PMSG）＋其他激素：性周期的8～12天注射一次PMSG ，两天后注射PGF2α促使黄体溶解，后48hr，母牛发情排卵，效果好三）供体、受体的同期发性发情的同步化：进行胚胎移植，必须使供体与受体同步发情，也就是有相同的生殖周期。

通常供、受体同时注射PGF2α，牛为0.4mg，羊为0.2mg 哺乳动物的生殖周期是各式各样的，有的一年只有一次发情期，有一定的生殖季节胚胎移植时受体与供体同步发情，处于相同的生殖生理状态，才可能使一个供体超数排卵获得的胚胎在多个受体子宫内受孕家畜同步化发情是胚胎移植能否成功的关键之一受体母畜与供体同时注射PGF2α四）供体的发性鉴定和配种 在正常情况下，供体大多数在超排处理结束后12~48h发性发情鉴定主要是以接受爬跨且站立不支为主要判定标准，辅以直肠检查一般在发情后8~12h第一次输精，以后每间隔8~12h输精一次，直到发性结束二、胚胎采集（一）采集胚胎时间以发情日为第零天，在第6~7.5天或第2~3天分别从子宫角或输卵管回收胚胎二）胚胎采集方法1.手术法采集方法（1）输卵管冲胚 用注射器的磨钝针头刺入子宫角尖端，注入冲胚液，然后从输卵管的伞部接取冲胚液，这种方法适用于在排卵后4天以内进行牛羊冲胚液用量为10ml即可2）子宫冲胚 从子宫角的输卵管端注入冲胚液，由基部接取；也可以由子宫角基部液注入冲胚液，另一端接取冲胚液用量依子宫角容积（母畜种类）大小而不同，羊一般为50~100ml.2.非手术法采集胚胎三、胚胎的检查及鉴定并非所以的胚胎都用于移植，因为受精卵可能有：质量问题；发育不完全；采集时受损。

显微镜下观察采集胚胎应该是：外观饱满、透明带完整、卵间隙小，卵裂球大小均匀，界限清晰，透亮充实，胞质均匀等一）捡卵捡卵借助于实体显微镜进行进口的特制集卵杯，上端连接在冲胚管的出口上，杯中筛也允许冲卵液流出，胚胎集中在杯底，直接在显微镜下捡卵，十分方便二）胚胎质量的鉴定和分级1.胚胎的鉴定在20~40倍实体显微镜下观察受精卵的形态、色调、分裂球的大小、均匀度、细胞密度、与透明带的间隙以及变性情况等2.胚胎的分级胚胎分A、B、C三个等级四、胚胎移植（一）手术法移植全身麻醉，手术将子宫和输卵管拉出，用钝形针在移植部位刺一个小孔，小心地将胚胎输入牛、羊3日龄以前的胚胎（8细胞前）移植部位为输卵管，将输卵管由输卵管伞插入输卵管内一定深度，将胚胎注入5日龄后的胚胎应移植到子宫角尖端，即在宫管结合部手术移植法移卵容易，损伤小二）非手术法移植方法已较完善，克服了移植器通过子宫颈的困难和子宫肌肉收缩排斥胚胎的技术问题，成功率明显提高但牛的非手术法只能移植5日龄以上的胚胎，用带套管的移植器，借助手将移植器尽可能达到子宫角，把卵注入有卵黄体的一侧子宫角内五、影响胚胎移植妊娠率的因素 胚胎因素： 包括胚胎质量、日龄、移植胚胎的数量、提供胚胎的供体、胚胎在体外停留的时间等。

母体因素： 包括供受体发情同期化程度、受体的孕酮水平、受体的营养、子宫和卵巢的生理状况等 其他因素： 包括自然发情和人工诱导发情、移植器污染程度以及操作者熟练程度等体外受精技术体外受精：是指通过人为操作使精子和卵子在体外环境中完成受精过程，又称试管胚技术体外受精基本原理在于人工模拟体内环境（营养、温度、温度、气体、渗透压、PH等），使卵母细胞复合体（COC）中的初级卵母细胞成熟，同时使精子获能，完成受精 意义：短时间内生产大量优质廉价的胚胎，加速良种家畜的繁育进程；并且为胚胎工程的其他研究如胚胎性别的鉴定、胚胎嵌合等提供合适的实验材料；借助于精技术还可揭示受精机理和早期胚胎的发育本质，为动物胚胎学、发育生物学提供生要的理论依据此外，该技术在拯救濒危物种和开发利用珍稀动物等方面也具有重要的实用价值体外受精技术的主要技术环节包括卵母细胞的获取和体外成、精子的体外获能、成熟卵母细胞与获能精子的体外受精、受精卵的体外培养和移植等一系列步骤一、卵母细胞的获取1.活体卵巢上采集 动物经超排处理后，用剖腹术、腹腔镜技术或超声波技术等在活体动物上直接采集卵泡卵母细胞2.屠宰后卵巢上采集无菌采集卵巢，放入30~39℃灭菌生理盐水，6h内带回实验室。

1）卵巢表面卵泡卵母细胞的获得 卵巢表面的卵母细胞是目前体外受精中卵母细胞的主要来源，采集方法有如下3种①抽吸法：用注射器配上12或18号针头，以PBS为抽卵液，从卵巢表面抽吸卵泡，将所获卵泡液直接注入检卵皿内，在显微镜下检卵；该方法简便、快速，缺点是易出现不完整的COC及裸卵②切割法：用刀片反复切割卵泡，然后用PBS（添加5%的犊牛血清）沿切口反复冲洗卵巢，回收COC③剥离法：剥离突出于卵表面的卵泡，放在卵母细胞培养液中，然后用针刺破眼科剪剪破卵泡，回收（2）卵巢内卵母细胞的获得 用单面刀片或一组特制刀片对卵巢深层组织进行切割可获得更多的COC二、卵母细胞的成熟培养 将花获得的COC进行分级，只有包被1层以上致密卵丘细胞、形态正常的卵母细胞才可进行成熟培养基础培养液中添加胎牛血清（FCS）经添加牛血清白蛋白（BSA）可获得更高的成熟率近年来有人报道，以发情牛血清（FCS）或发情山羊血清（FCS）代替FCS效果更佳在基础培养液中添加促性腺激素，对卵母细胞体外成熟具有十分重要的作用常用的有促黄体生成激素 (LH)+ 卵泡刺激素（FSH）三、精子获能精子体外获能是体受精技术听关键环节之一。

主要包括两方面内容：一是精子的洗涤，洗涤液一般用不含牛血清白蛋白(BSA)的BO液或m-Tyrode’s液；二是添加某些特定成分(如肝素、BSA、咖啡因等)，诱导精子获能和顶体反应研究表明，发情期牛输卵管液中氨基多糖（GAG）是牛精子体内获能的主要物质GAG可促进精子对钙离子的吸收，从而放发顶体反应肝素是高度硫酸化的GAG咖啡因能够增强夺素的诱导作用在精子获能过程，BSA可以降低精子顶体膜中胆固醇的浓度，有利于顶体反应精子获能之后，BSA可促进其迅速透卵子因此，BSA作为辅助成分广泛用于家畜精子的体外获能四、体外受精 体外受精的操作就是将获能的精子和成熟的卵子置于受精液中共同培养，使之完成受精过程受精液与获能液通常国同一种液体精子浓度对体外受精的成败有一定影响精子浓度过高与过低均不利于受精因特种不同，所用浓度差异较大一般为（0.5~3）×106个/ml精、卵相遇时间也对体外受精效果产生影响，如在遇到卵子前就成了顶体反应，精子实际上已经失去了受精能力不成熟或老化的卵母细胞，也不能完成正常的受精过程五、受精卵的体外培养体外受精的早期胚胎在体外发育过程中，往往会停滞在某一阶段不再发育，这种现象叫“发育阻断”。

为克服发育阻断，近年来试验建立了共培养体系为了提高胚胎的体外发育率，国内外学者相继建立了许多体外培养体系，如将早期胚胎移入同期发情的受体输卵管内培养、单独一种体细胞单层与胚胎共培养、几种体细胞混合形成单层后与胚胎共培养等从体外培养效果和操作难易程度方面考虑，目前绝大多数采用的还是单一体细胞单层与胚胎共培养体系现在制备单层所用的体细胞类型主要有成纤维细胞、vero细胞、颗粒细胞、输卵管上皮细胞和子宫上皮细胞等，但从细胞来源、操作简易方面考虑，颗粒细胞具有无可比拟的优势，因此成为国内外学者制作培养单层时的首选细胞目前广泛采用的是输卵管上皮细胞共培养体系和颗粒细胞单层共培养体系1. 输卵管上皮细胞共培养体系输卵管上皮细胞对IVF早期胚胎的发育有明显的作用目前，该共培养体系有两种方式：一是将早期胚胎与预先制作的单层输卵管上皮细胞共同培养，二是用条件培养液（CM）培养早期胚胎将输卵管上皮细胞用TCM199+20%ECS培养，每20h收集一次培养液，离心后调整PH到7.4，即为CM2. 颗粒细胞单层共培养体系六、存在问题第一，体外受精的效率有待提高第二，体外培养体系有待进一步完善第三，基础理论研究有待加强。

注解：PBS溶液　　PBS溶液又称磷酸盐缓冲溶液，一般选择K2HPO4和KH2PO4配制，因为钠盐溶解的较慢根据不同pH的溶液，称量不同质量的磷酸盐，也可以用pH计调溶液的pHPBS一般用作支持电解质　　其配置方法如下：　　采用去离子水、KH2PO4和Na2HPO4·2H2O配制PBS溶液，按以下步骤进行：　　(1) 配制1/15mol/L KH2PO4，即每升水中溶解9.078克KH2PO4；　　(2) 配制1/15mol/L Na2HPO4·2H2O，即每升水中溶解11.876克Na2HPO4·2H2O；　　(3) 将18.2%（体积分数）KH2PO4溶液和81.8% Na2HPO4·2H2O；混合；　　最终 测定PBS液的PH值约为7.4。